DNA甲基化的檢測隨心選集

2016年10月05日訊 密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的表觀遺傳學(xué)核心實驗室于2015年6月啟動并運行。第一年，這個機構(gòu)處理了402個樣品。由此可見，相當多的研究人員對DNA甲基化感興趣。據(jù)實驗室主任Claudia Lalancette介紹，這個服務(wù)有很大的需求，因為檢測有點棘手。人們需要一定的經(jīng)驗。

DNA甲基化，通常是指CpG島上第5位胞嘧啶堿基上的甲基化標記（5-mC）。這被人們稱為“第五種堿基”。它是一種重要的表觀遺傳學(xué)標記，可能明顯改變基因的時空表達和染色質(zhì)重塑。

最近的一篇綜述顯示，5-mC參與了基因組印記、X染色體失活、轉(zhuǎn)座子抑制、基因調(diào)控和表觀遺傳記憶的維持。最近的研究還表明，公認的原核生物甲基化標記N6-甲基腺苷也存在于真核生物DNA中。

既然研究人員這么熱衷于檢測5-mC及其衍生物，生命科學(xué)領(lǐng)域的廠商就開發(fā)出許多種試劑和試劑盒，以協(xié)助他們開展研究。

檢測隨心選

據(jù)Lalancette介紹，密歇根大學(xué)的表觀遺傳學(xué)核心實驗室提供幾種服務(wù)?？蛻糇畛Ｓ嗁彽氖荅RRBS（增強精簡表示亞硫酸氫鹽測序），這種方法可以單核苷酸的分辨率檢測5-mC?；蚪MDNA被限制性內(nèi)切酶片段化，然后跑膠。通過選擇150-400 bp范圍內(nèi)的片段，用戶可獲取基因組內(nèi)大多數(shù)富含CpG的區(qū)域，從而最大程度提高下游測序的效率。

這種方法離不開亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，這個過程將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。通過比較處理和未處理的測序片段，研究人員可以確定哪些堿基被甲基化。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒可從多個廠家購買，包括Active Motif、默克密理博和Zymo等。

對于那些需要了解局部甲基化狀態(tài)的研究人員，Lalancette的實驗室提供定向MassARRAY測序。它通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、PCR擴增和體外轉(zhuǎn)錄，然后對尿嘧啶殘基進行特異切割，從而檢測甲基化的堿基。這個結(jié)果可在專門的飛行質(zhì)譜儀上讀取，如Agena Biosciences的平臺?！癕assARRAY被認為是甲基化定量的金標準，”Lalancette談道。

另外一個受歡迎的檢測產(chǎn)品是確定5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的位置。5-hmC是5-mC的一個變種，似乎有著不同的表觀遺傳學(xué)功能。然而，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化不能區(qū)分這兩種標記，因此研究人員開發(fā)出新的方法。Lalancette的實驗室利用抗體來富集含有5-hmC的DNA，之后進行DNA測序。這種策略帶來了區(qū)域性的分辨率，而非核苷酸水平。

分辨率更高

檢測5-hmC當然還有其他方法，如TAB-seq和OxBS-seq，這兩種方法在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化之前處理DNA，以改變甲基化和羥甲基化堿基的反應(yīng)。在TAB-seq中，5-hmC經(jīng)過β-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的處理被保護，而5-mC則被Tet酶轉(zhuǎn)化成5-羧基半胱氨酸。隨后的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化將5-caC讀取為T，將5-hmC讀取為C。OxBS-seq利用化學(xué)氧化將5-hmC轉(zhuǎn)化為5-甲酰胞嘧啶，它在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后讀取為T，而5-mC讀取為C。在這兩種情況下，比較測序產(chǎn)生的序列可發(fā)現(xiàn)修飾的堿基。

另一個區(qū)分這兩種修飾的方法是利用Pacific Biosciences的SMRT測序。SMRT測序根據(jù)核苷酸摻入的動力學(xué)來自動區(qū)分5-mC和5-hmC上的胞嘧啶。據(jù)這家公司的首席科學(xué)官Jonas Korlach介紹，這個參數(shù)被稱為脈沖持續(xù)時間。不過通過糖基化修飾5-hmC之后，這個信號更容易分辨。

ELISA方案

對于那些不需要核苷酸水平分辨率的研究人員而言，Active Motif、默克密理博和Zymo提供了ELISA檢測，可探索整體的甲基化改變。Active Motif利用生物素化的寡核苷酸來捕獲細胞中相對一部分的甲基化區(qū)域，這些寡核苷酸與CpG島中的LINE重復(fù)序列互補。隨后捕獲的DNA被固定在微量滴定板上，與5-mC抗體孵育，并利用顯色試劑檢測。據(jù)介紹，它可以檢測到樣品之間0.5%-1%的差異。

研究甲基化DNA的其他試劑包括專門的甲基化DNA標準品、酶、抗體及其他。如果你希望從基因組DNA樣品中富集甲基化或羥甲基化的DNA，你可以選擇MeDIP/hMeDIP （甲基化DNA免疫沉淀）和MIRA（甲基化CpG島回收分析）產(chǎn)品。對于前者，甲基化DNA是利用5-mC或5-hmC抗體沉淀的，這需要單鏈DNA；而MIRA使用甲基DNA結(jié)合蛋白，它識別雙鏈DNA。

舉個例子，Active Motif的MethylCollector? Ultra kit是基于MIRA，Hydroxymethyl Collector? kit則通過糖基化和生物素化來修飾5-hmC，以實現(xiàn)純化。Zymo的Quest 5-hmC? DNA Enrichment Kit利用J堿基結(jié)合蛋白（JBP）直接純化糖基化的5-hmC殘基。

當然，更多的工具正在涌現(xiàn)。至少有三個研究小組獨立報告了將只具有催化功能的Cas9酶與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或DNA去甲基化酶相融合，可控制特定位點的甲基化狀態(tài)和基因表達水平；其中一些試劑可從Addgene上獲取?？紤]到DNA甲基化領(lǐng)域的熱度不減，未來肯定有更新的產(chǎn)品。大家需要多關(guān)注產(chǎn)品目錄或生物通。

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