那些中國(guó)學(xué)者發(fā)表的重要冷凍電鏡研究發(fā)現(xiàn)

2016年09月20日訊 冷凍電子顯微技術(shù)（cryo-electron microscopy, cryo-EM）在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。早在七八年前，清華大學(xué)就開(kāi)始重視冷凍電鏡技術(shù)，投入了大量資金用于冷凍電鏡設(shè)施的建設(shè)。這個(gè)決定使清華在冷凍電鏡領(lǐng)域，無(wú)論是從科研設(shè)備還是人才成果等方面都躋身世界領(lǐng)先水平。

近期來(lái)自清華大學(xué)生科院的施一公教授發(fā)表綜述：“Biological cryo-electron microscopy in China”，回顧了冷凍電鏡在中國(guó)的發(fā)展歷史，描述了目前的發(fā)展?fàn)顟B(tài)，并展望了這種技術(shù)將會(huì)為生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域帶來(lái)什么樣的影響。

在這篇文章中，施一公教授介紹了十多項(xiàng)近年來(lái)中國(guó)學(xué)者在電子顯微，冷凍電鏡上的重要成果，那么首先什么是冷凍電鏡呢？

在此前施教授的演講中他曾提到，冷凍電鏡就是把電子打在樣品上，經(jīng)過(guò)傅里葉變換，最后收集圖象，進(jìn)行particle classification（粒子分類），最后重構(gòu)出一個(gè)三維的結(jié)構(gòu)。樣品是動(dòng)態(tài)的，把樣品放在一個(gè)格柵上面，最后把它弄得很薄，然后冷凍，不同的方向都會(huì)被保存下來(lái)，這樣透射電鏡透射以后這個(gè)投影會(huì)出現(xiàn)不同的圖像，然后通過(guò)三維的重構(gòu)把原始圖像放在一起。

一直以來(lái)，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有三種主要方法：X射線晶體衍射、核磁共振以及單顆粒冷凍電子顯微鏡（冷凍電鏡）。其中冷凍電鏡異軍突起如此之迅猛，2015年也成為Nature雜志評(píng)選的年度技術(shù)（Method of the Year），這兩年的革命性進(jìn)展，一是它的照相機(jī)技術(shù)，二是其軟件分析的圖像處理技術(shù)，尤其是前者的進(jìn)步大幅提高了冷凍電鏡的解析能力。另外幾前該領(lǐng)域出現(xiàn)了一項(xiàng)新技術(shù)突破：“直接電子檢測(cè)裝置”。這個(gè)裝置可以讓分辨率大大提高，為這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用起到了至關(guān)重要的作用。

染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

大小為30nm的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的組織構(gòu)架與動(dòng)態(tài)機(jī)制都在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演了重要的角色，中科院生物物理研究所的朱平研究員曾于1999年在佛羅里達(dá)州大學(xué)從事冷凍電鏡的博士后研究工作，他一直致力于艾滋病病毒AIDS包膜糖蛋白ENV的研究，曾作為第一作者在Nature上發(fā)文，利用冷凍電鏡詳細(xì)描述了AIDS病毒表面上的蛋白刺，這些蛋白刺可讓該病毒非常有效地與人體免疫細(xì)胞結(jié)合和融合。每個(gè)病毒體在每個(gè)粒子上平均有14個(gè)刺，其中的一些刺是聚集在一起的，這個(gè)特點(diǎn)與病毒組裝、感染及中和機(jī)制都有關(guān)系。

去年，其研究組在Science上發(fā)文，首次解析了30nm的高分辨率三維結(jié)構(gòu)并提出了一種全新的染色質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)模型。

在研究者“看”到的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，DNA上每?jī)蓚€(gè)相鄰的核小體通過(guò)中間連接的DNA“相對(duì)而望”，順著左手螺旋的方向讓DNA絲沿“Z”型路線往上堆疊，形成直徑30nm的染色質(zhì)絲--相鄰核小體間并沒(méi)有H1組蛋白的相互作用，但H1組蛋白在整個(gè)結(jié)構(gòu)的堆疊模式上起了很大的作用。這個(gè)結(jié)構(gòu)有力地印證了之前許多相關(guān)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，與核小體的晶體結(jié)構(gòu)也有很高的一致性。不僅如此，這份3D“照片”推翻了之前科學(xué)界推測(cè)的模型：在這之前，科學(xué)家們普遍假設(shè)這段結(jié)構(gòu)是6個(gè)核小體圍成的“玫瑰花結(jié)”往復(fù)堆疊；而這項(xiàng)研究證實(shí)，真實(shí)結(jié)構(gòu)是每四個(gè)核小體為單位的左手螺旋。中國(guó)學(xué)者獨(dú)家發(fā)表Science文章解析染色質(zhì)

免疫應(yīng)答受體

自1989年Charles Janeway在冷泉港會(huì)議上提出模式識(shí)別受體假說(shuō)以來(lái)，在高等動(dòng)物中迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三大家族的模式識(shí)別受體，分別是Toll-樣受體（TLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因-樣受體（RLR）和Nod受體（NLR）。其中NLR是一種具有識(shí)別入侵病原體和激活先天免疫反應(yīng)重要功能的胞內(nèi)模式識(shí)別受體。

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的柴繼杰教授一直以來(lái)都對(duì)哺乳動(dòng)物免疫監(jiān)控系統(tǒng)中的這些受體十分感興趣，2013年，他在Science雜志上發(fā)表文章，首次報(bào)道了小鼠NOD樣受體NLRC4自抑制狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)，并通過(guò)結(jié)構(gòu)分析和生化實(shí)驗(yàn)揭示了該蛋白維持自抑制作用的分子機(jī)制，這也是NOD樣受體家族中第一個(gè)被解析出的近乎全長(zhǎng)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。

膜內(nèi)蛋白酶與γ-分泌酶

施一公教授自2005年開(kāi)始就一直從事膜內(nèi)蛋白酶的研究，他曾利用X射線晶體技術(shù)解決了絲氨酸蛋白酶與鋅金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)難題，其終極目標(biāo)是γ-分泌酶，人體來(lái)源的γ-分泌酶與多種疾病有關(guān)，如阿茲海默癥。

2012年，清華大學(xué)的研究人員在Nature雜志上報(bào)告了一個(gè)presenilin/SPP家族膜內(nèi)天冬氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)（清華施一公最新Nature文章 ）。2014年7月，揭示出了人類γ-分泌酶的三維結(jié)構(gòu)，該研究對(duì)于深入了解γ-分泌酶的功能機(jī)制，開(kāi)發(fā)出預(yù)防及治療阿爾茨海默氏癥及某些類型的癌癥的新型γ-分泌酶抑制劑具有重要的意義。

2014年9月，施一公研究小組揭示出了γ-分泌酶組件nicastrin的晶體結(jié)構(gòu)，這為理解γ-分泌酶的組裝及工作機(jī)制，以及阿爾茨海默氏癥的發(fā)病機(jī)理提供了重要線索。

2015年8月，施一公課題組與劍橋生物醫(yī)學(xué)院的研究人員合作，他們采用單顆粒冷凍電子顯微鏡首次獲得了完整人類γ-分泌酶（γ-secretase）的原子結(jié)構(gòu)，研究結(jié)果發(fā)布Nature雜志上。這項(xiàng)研究為更深入地了解γ-分泌酶的功能機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)，對(duì)于開(kāi)發(fā)出預(yù)防及治療阿爾茨海默氏癥的新型γ-分泌酶抑制劑具有重要的意義。

離子通道

清華大學(xué)的顏寧教授希望能解開(kāi)骨骼肌與心肌中Na+和Ca2+離子通道的結(jié)構(gòu)謎題，2012年其研究組發(fā)表文章，解析了電壓門(mén)控鈉離子通道NavRh的三維晶體結(jié)構(gòu)，首次從結(jié)構(gòu)的角度報(bào)道了抑制離子鈣離子在電壓門(mén)控鈉離子通道的結(jié)合位點(diǎn)，也是首次獲得處于滅活構(gòu)象的電壓門(mén)控離子通道。這項(xiàng)工作不但為真核電壓門(mén)控鈉離子通道功能的進(jìn)一步研究提供了有力的結(jié)構(gòu)依據(jù)，而且為該領(lǐng)域存在的重大爭(zhēng)議問(wèn)題提供了結(jié)構(gòu)線索。此外，相對(duì)高性價(jià)比的純化和結(jié)晶方法，使得NavRh可以用來(lái)進(jìn)行以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)和藥物篩選。

此后，在此技術(shù)上，顏教授研究組又在Science上發(fā)文，首次報(bào)道了真核生物電壓門(mén)控鈣離子通道的4.2埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

他們利用單顆粒冷凍電鏡方法，重構(gòu)出了分辨率為4.2埃的兔源Cav1.1蛋白復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，首次展示了Cav1.1各個(gè)亞基的相互作用界面和亞基內(nèi)部結(jié)構(gòu)域的分布情況，揭示了各個(gè)輔助亞基（a2d，b，g）調(diào)控離子通道亞基（a1）的分子機(jī)理，為理解真核Cav和Nav的功能以及它們與疾病相關(guān)的機(jī)制提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

今年顏教授研究組在Nature上發(fā)表的文章在3.6??的標(biāo)稱分辨率上，解析了兔Cav1.1復(fù)合物的冷凍電子顯微鏡結(jié)構(gòu)，報(bào)道了首個(gè)真核電壓門(mén)控鈣離子通道的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)。

光合作用

植物光合作用由一系列光驅(qū)動(dòng)，葉綠體膜上的多個(gè)超分子過(guò)程組合完成，其中綠色植物光系統(tǒng)II（PSII）的主要捕光復(fù)合物L(fēng)HC-II是植物光合作用中主要的太陽(yáng)能收集器，它負(fù)責(zé)吸收光能并將能量進(jìn)一步傳遞給光反應(yīng)中心。

2004年，中科院生物物理所，植物所合作報(bào)道了菠菜主要捕光復(fù)合物 （LHC-II） 2.72 ?分辨率的晶體結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)了膜蛋白結(jié)晶的一種全新方式，并首次報(bào)導(dǎo)了二十面體狀的膜蛋白-脂質(zhì)體復(fù)合物的空心球體的結(jié)構(gòu)。在這一結(jié)構(gòu)中，他們測(cè)定了包括蛋白質(zhì)分子、色素分子、脂分子和水分子在內(nèi)的近三萬(wàn)個(gè)獨(dú)立原子的高精度三維坐標(biāo)數(shù)據(jù)。結(jié)構(gòu)研究結(jié)果揭示了色素分子在LHC-II中的排布規(guī)律，建立了該復(fù)合體內(nèi)完整的能量傳遞網(wǎng)絡(luò)，并提出了一個(gè)基于結(jié)構(gòu)的光保護(hù)分子機(jī)理的模型。

時(shí)隔幾十年，當(dāng)年參與研究的研究生柳振峰與常文瑞已經(jīng)在各自的領(lǐng)域取得了重要成果，今年前者在Nature上發(fā)文，報(bào)道了菠菜光系統(tǒng)II（Photosystem II）-捕光色素復(fù)合物（LHC-II）超級(jí)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，分辨率為3.2埃。

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