清華顏寧教授Nature發(fā)文，解構鈣通道的不懈追求

2016年09月19日訊 電壓門控鈣離子通道（Cav）在神經傳導和肌肉收縮等關鍵生命過程中發(fā)揮著核心角色，其異?？蓪е律窠洝⑿难?、肌肉等多種系統的疾病，因此也成了一類重要的藥物靶點。要想充分利用Cav進行藥物開發(fā)，我們顯然需要對其結構及功能特征進行全面了解。然而，由于技術手段等限制，在Cav的結構和功能領域仍有很多不解之謎。

不過，經過多年的研究，我們對于Cav已經有了一定的基本了解。在達到特定闕值的細胞膜電位下，Cav可被激活，從而讓Ca從中穿過，進而引發(fā)一系列由Ca2+介導的信號通路。Cav可被分為Cav1、Cav2和Cav3三大家族。其中，Cav1由具有門控和跨膜通道功能的α1亞基，以及對其活性和動力學進行調節(jié)的輔助亞基構成，后者包括位于胞外的α2δ亞基、胞內的β亞基和跨膜的γ亞基。

在各種Cav1當中，Cav1.1是第一個基因被成功克隆出來的Ca2+電壓門控通道，并成為了后續(xù)被發(fā)現的其他Cav結構和功能的研究原型。Cav1.1本身參與肌肉興奮收縮偶聯過程。骨骼肌細胞在興奮信號作用下會發(fā)生膜電位的變化，這會促使Cav1.1與肌質網膜上的RyR1蛋白發(fā)生相互作用，導致RyR1將肌質網中的Ca2+快速大量地釋放到細胞質中，進而引起骨骼肌收縮。

在之前的研究中，顏寧教授的團隊曾經通過冷凍電鏡技術，以4.2埃的分辨率解析了兔Cav1.1的結構，成為首個解構被解析的真核生物電壓門控Ca2+通道蛋白。然而，由于分辨率有限，仍有相當部分的Cav1.1結構未被解析。

最近，顏寧教授的團隊取得關鍵突破，通過改進實驗條件，將解析Cav1.1結構的分辨率提高到了3.6埃，從而揭示了這一重要的離子通道蛋白之前尚未解析的工作機理細節(jié)。這一成果發(fā)表于近期的《Nature》期刊上。

在這一新的3.6埃結構圖中，α2δ亞基的結構首次被基本完全地解出，由相互串聯的四個cache結構域和一個von Willebrand因子A（VWA）結構域組成。

研究者們還成功得到了具有門控和跨膜通道功能的α1亞基的原子模型。在該模型中，α1亞基處于封閉狀態(tài)，由一個核心結構域（pore domain）、四個電壓感受結構域（VSDI-VSDIV）和位于細胞內側的α1亞基相互作用（AID）結構域組成。

其中，四個VSD的組成相似，均由六根跨膜螺旋組成（S1-S6），不過在具體的構象上又不盡相同。感受電壓的氨基酸殘基均位于S4上的一側，多達六個（R1-R6），主要為精氨酸和賴氨酸。在這六個氨基酸當中，有四個（R1-R4）均位于門控電荷轉移中心內具有高度保守性和封閉性的苯丙氨酸殘基的上方，更加接近于細胞外側，因此處于所謂的“去活化”或“向上”的狀態(tài)。這說明，此次解出的Cav1.1結構很可能是處于非活化的狀態(tài)。

在核心結構域中，伸向細胞外側的環(huán)狀結構由環(huán)內的二硫鍵穩(wěn)定，以此在離子通道中的“選擇性濾器”（selectivity filter）上方形成了一個帶窗口的穹頂結構。其中，“窗口”部位富含帶負電的氨基酸殘基，因此可能是Ca2+進入選擇性濾器的主要入口。同時，“穹頂”的另一部分為輔助性的胞外α2δ亞基提供了結合位點。而在選擇性濾器下方，則有著典型的疏水性側入口（side portal）結構，可與細胞膜中的脂質分子穩(wěn)定結合，并將核心結構域與細胞質組分完全隔開。

此外，研究者們揭示了同樣跨膜的γ亞基結構及其與α1亞基相互作用的許多新信息。γ亞基除了已知的四個跨膜螺旋（TM1-TM4）之外，還有位于細胞外側的一個β-折疊結構，以及分別位于亞基N端和C端的兩段位于細胞內側的環(huán)。其中，γ亞基的TM2和TM3通過與α1亞基VSDIV的S3和S4的疏水相互作用，將兩亞基結合在一起。此外，γ亞基和α1亞基細胞內側還可能通過氫鍵讓二者進一步結合在一起。

不過，盡管從4.2埃到3.6埃已經是具有重大意義的進步，β亞基的結構仍然沒有在3.6埃的結構圖中顯示出現。為此，研究者們對Cav1.1蛋白顆粒進行了進一步的三維結構分類，從中得到兩組顆粒，并以此又構建了兩個分辨率為3.9埃的結構圖，從而成功地解出了位于胞內的β亞基的結構。同時，α1亞基的胞內部分也更加清晰的顯示了出來。

結果顯示，α1亞基的I-II和III-IV接頭螺旋（linker helix）分別與β亞基和α1亞基C末端結合。此外，在上述兩種3.9埃結構圖中，β亞基和與之接近α1亞基部分的位置有著顯著的不同，這提示著Cav1.1中可能的構象轉變模式。

顏寧教授課題組的工作為我們首次提供了一個較為完整的Cav1.1通道蛋白的近原子結構模型，為對肌肉興奮收縮偶聯過程進行根本性的解讀提供了基礎。不僅如此，Cav1.1通道蛋白結構的成功解析使得與之進化上相近的Ca2+或Na+離子通道蛋白的同源建模和工程改造成為可能，為解讀這兩類通道蛋白功能和相關病理提供可行的三維結構模型，并為基于上述結構的藥物設計提供了重要基礎。

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