Nature：利用CRISPR/Cas9鑒定出線粒體疾病背后的遺傳秘密

中醫(yī)世家 2024-06-02 11:21:25

Nature：利用CRISPR/Cas9鑒定出線粒體疾病背后的遺傳秘密

2016年09月17日訊在一項(xiàng)新的研究中，來自澳大利亞莫納什大學(xué)莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所等機(jī)構(gòu)的研究人員鑒定出兩個新的基因與線粒體疾病的一種主要病因相關(guān)聯(lián)

。他們的研究為更好地對線粒體疾病進(jìn)行遺傳診斷鋪平道路

，而且也可能有助于鑒定出用于治療的潛在治療靶標(biāo)

。相關(guān)研究結(jié)果于2016年9月14日在線發(fā)表在Nature期刊上

，論文標(biāo)題為“Accessory subunits are integral for assembly and function of human mitochondrial complex I”。論文通信作者為來自莫納什生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)研究所的David Stroud博士和Mike Ryan教授

。

線粒體疾病是一種讓患者缺乏能量

、損傷肌肉和諸如大腦和心臟之類的主要器官的疾病。在澳大利亞

，每5000名嬰兒當(dāng)中大約就有一人---或者說每周就有1名出生的澳大利亞嬰兒---在出生時患有一種嚴(yán)重的線粒體疾病

，這種疾病經(jīng)常能夠?qū)е略缡拧?/p>

Ryan教授說，他們不僅鑒定出兩個新的基因ATP5SL和DMAC1與線粒體疾病的一種主要病因相關(guān)聯(lián)

，而且也發(fā)現(xiàn)30種蛋白組分在驅(qū)動線粒體運(yùn)轉(zhuǎn)的呼吸鏈酶復(fù)合體I 中發(fā)揮著重要作用

。

Ryan教授說，“如此多不同的基因促進(jìn)我們的線粒體發(fā)揮功能的事實(shí)解釋著為何如此多的病人仍然未被確診---它是一種復(fù)雜的疾病

?div id="m50uktp" class="box-center"> ！?/p>

線粒體是我們的細(xì)胞的能量工廠，從我們吃的食物中獲得糖和蛋白

，并將它們轉(zhuǎn)化為我們的身體能夠使用的能量

。這一過程給我們提供我們的身體正常運(yùn)轉(zhuǎn)所需的90%以上的能量。

在患有線粒體疾病的病人當(dāng)中

，線粒體不能夠產(chǎn)生這種能量

，這能夠?qū)е缕鞴俟δ芩ソ撸覞撛诘貙?dǎo)致死亡

。

為了揭示線粒體疾病的一種主要病因背后的遺傳秘密

，研究人員研究了呼吸鏈酶復(fù)合體I，即協(xié)助驅(qū)動線粒體的引擎之一

。Ryan教授說

，相比于細(xì)菌呼吸鏈酶復(fù)合體I，人呼吸鏈酶復(fù)合體I是由30多種蛋白組分組成的

。

Ryan教授說

，“這總是一個秘密，這是因?yàn)榧?xì)菌呼吸鏈酶復(fù)合體I和人呼吸鏈酶復(fù)合體I具有相同的總體功能

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“我們的研究表明幾乎所有附加的蛋白組分對人健康是至關(guān)重要的?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">！?/p>

利用一種前沿的被稱作CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)

，研究人員對一系列細(xì)胞進(jìn)行修飾而讓它們具有一種不同的遺傳組分---每個細(xì)胞類型缺乏一個獨(dú)特的與僅在人類中發(fā)現(xiàn)的呼吸鏈酶復(fù)合體I蛋白相關(guān)聯(lián)的基因。他們開發(fā)的這種方法可能能夠在全世界的實(shí)驗(yàn)室中被用來研究更多的導(dǎo)致線粒體疾病的基因

。

Ryan教授說

，人類擁有的額外的蛋白組分可能讓人呼吸鏈酶復(fù)合體I要比在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的呼吸鏈酶復(fù)合體I更加穩(wěn)定

。

“這可能是必需的，這是因?yàn)槲覀兊募?xì)胞要比每20分鐘發(fā)生分裂的細(xì)菌存活更長的時間

?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">！?/p>

研究人員發(fā)現(xiàn)的這兩個新的基因參與組裝呼吸鏈酶復(fù)合體I。Stroud博士說

，他們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)證實(shí)讓他們鑒定出的這兩個新的基因中的任何一個發(fā)生突變都會破壞呼吸鏈酶復(fù)合體I和線粒體功能

。

Stroud博士說，“如今在全世界

，這兩個新的基因能夠被加入到遺傳篩查清單中

，這將導(dǎo)致更早地診斷出更多的患有這種疾病的人?div id="4qifd00" class="flower right">

！?/p>

基于CRISPR/Case9全基因組敲除文庫篩選功能基因

1. 文庫構(gòu)建：針對某個物種

，每個基因設(shè)計(jì)3個或以上的sgRNA，高通量合成sgRNA

，然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒載體中

。

2. 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)：包裝GeCKO慢病毒文庫，并以低MOI（一般標(biāo)準(zhǔn)<0.3）感染靶細(xì)胞

，保證一個病毒顆粒感染一個細(xì)胞

，篩選同時表達(dá)sgRNA和Cas9的細(xì)胞；每個細(xì)胞都只會敲除自身攜帶的sgRNA對應(yīng)的一個基因

，細(xì)胞文庫中包含的細(xì)胞的數(shù)量一般為細(xì)胞文庫中全部sgRNA數(shù)量的100-1000倍

。

3. 表型篩選：將全基因組敲除細(xì)胞庫分成兩份，其中一份作為實(shí)驗(yàn)組施加篩選壓力

，如：病毒侵染

，藥物治療等；另一份作為對照組

。根據(jù)耐藥性

、增殖能力、存活能力等表型篩選細(xì)胞

。

4. 候選基因的分析：將實(shí)驗(yàn)組和對照組的細(xì)胞分別抽提基因組

，PCR擴(kuò)增sgRNA片段，高通量測序

，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析

。

根據(jù)篩選目的的不同，分為陽性篩選和陰性篩選

。陽性篩選是對已成功整合sgRNA的細(xì)胞文庫施加一定的篩選壓力

，僅使少數(shù)目的表型的細(xì)胞能夠存活，達(dá)到富集關(guān)鍵基因的目的

。陰性篩選與之相反

，存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞

，需要比較不同時間點(diǎn)sgRNA的豐度找出差異sgRNA來確定關(guān)鍵基因，陰性篩選可以鑒定出引起細(xì)胞某些功能缺失的基因

，如篩選時間較長

，可以篩選到細(xì)胞生存所必需的基因。

個人理解：陽性

、陰性篩選或者正向

、負(fù)向篩選聽起來容易混淆，其實(shí)在英文中就2個詞

，positive selection和negative selection，無論怎么選擇

，最后都是看sgRNA的計(jì)數(shù)情況

，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定候選基因。如果最后選出的細(xì)胞內(nèi)富集的sgRNA所靶向的基因就是我們要的目的基因

，那么這種選擇我們稱其為positive selection

。相反，如果最后富集的sgRNA并不是我們實(shí)驗(yàn)想要的

，我們通過比較不同時間點(diǎn)的sgRNA變化進(jìn)而推斷候選基因

，這樣的選擇稱之為negative selection。舉個例子

，我們要篩選細(xì)胞生長的必需基因

，如果把這個基因敲除了（這個基因由其對應(yīng)的sgRNA作為標(biāo)記，每個細(xì)胞內(nèi)都敲除了一個基因）

，那么細(xì)胞肯定不能存活了

，對應(yīng)的sgRNA肯定也不會富集。所以存活的細(xì)胞意味著沒有敲除必需基因

，隨著細(xì)胞的增值

，整合到其基因組上的sgRNA大量富集，我們最終測到了這些sgRNA

，但其靶向的基因敲除了并不影響細(xì)胞生長

，所以這些基因不是目的基因。因此我們比較不同時間點(diǎn)sgRNA的消耗情況

，那些sgRNA明顯減少的

，其靶向的基因才是必需基因。

那么什么情況下是positive selection

？我們知道

，這兩者是反的，所以假如我們想篩選細(xì)胞生長的抑制基因（和必需基因相反）

，這種情況就屬于positive selection（和negative selection相反）

。如果敲除了抑制基因

，顯然細(xì)胞可以正常增值，抑制基因?qū)?yīng)的sgRNA也能不斷富集

，這兩個方向是相同的

。

如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候選基因，則為positive selection

，否則為negative selection

。

①篩選炭疽毒素使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因

由于毒素的強(qiáng)選擇性壓力，大多數(shù)細(xì)胞都會死亡

，只有少量的細(xì)胞存活和增殖

，這些存活的細(xì)胞內(nèi)富集了大量sgRNA，而這些sgRNA靶向的基因是被敲除的

，這些基因就是使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因

，正是由于這些目的基因被敲除，細(xì)胞才得以存活

。

Zhou等（2014）利用敲除文庫篩選

，在初步確定的291個基因中成功鑒定出炭疽和白喉毒素致細(xì)胞中毒所必需的宿主基因，并通過功能驗(yàn)證得到了證實(shí)

。

②篩選藥物敏感基因

細(xì)胞若含有藥物敏感基因?qū)⑹タ顾幮?div id="d48novz" class="flower left">

。若敲除了敏感基因，則可以存活

，最終富集的sgRNA正是實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰膕gRNA

。

①鑒定細(xì)胞生長必需的基因

一個時間段內(nèi)的連續(xù)生長，減少的細(xì)胞中往往攜帶靶向細(xì)胞增殖所必需基因的sgRNA

。這些基因可以通過比較每個sgRNA的相對頻率來找到

。陰性篩選的一個重要應(yīng)用是鑒定癌細(xì)胞生長所必需的基因，而這些基因可能成為治療癌癥的新靶標(biāo)

。

2014年

，Shalem等首次利用GeCKO文庫鑒定出人黑色素瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因，研究結(jié)果與RNAi篩選結(jié)果高度一致

。

②篩選藥物抗性基因

若敲除了抗藥性基因

，細(xì)胞在藥物壓力下不能存活，存活的細(xì)胞內(nèi)并沒有敲除目的基因

，最終富集的sgRNA不是目的sgRNA

，需要通過與對照組比較sgRNA消耗情況（或不同時間點(diǎn)的sgRNA豐度）來確定目的基因。

1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

，去除低質(zhì)量的reads

，使用clean reads data進(jìn)行后續(xù)分析。

2.比對分析：將測序數(shù)據(jù)中拼接reads與sgRNA 文庫序列比對

，并對sgRNA 文庫中完全匹配的sgRNA 數(shù)目

、丟失sgRNA

、基尼指數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

?Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)

? Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library

? Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)

? TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library

? ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)

? GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )

3.sgRNA 及基因的read counts 統(tǒng)計(jì)

CRISPR全基因組篩選的主要內(nèi)容便是統(tǒng)計(jì)sgRNA在不同樣本間的消耗和富集情況

，進(jìn)而推斷候選基因

。

4.主成分分析和樣品相關(guān)性聚類分析

有助于考察樣本間的相似性和差異，評估實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性以及對后續(xù)數(shù)據(jù)分析起到一定指導(dǎo)作用

。對于有重復(fù)的實(shí)驗(yàn)來說

，樣本同一處理不同重復(fù)應(yīng)該盡可能聚在一起，若存在個別重復(fù)樣本明顯偏離

，可以考慮剔除該樣本

。樣品聚類還可用于判斷數(shù)據(jù)處理中是否剔除了批次效應(yīng)。

5.候選基因篩選

MAGeCK-RRA算法根據(jù)測序結(jié)果中sgRNA的富集情況產(chǎn)生對應(yīng)基因位點(diǎn)的RRA得分

，RRA得分代表基因的必要性

，RRA得分越小表明其重要性越高。MAGeCK返回RRA lo value（neg|score

、pos|score）檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯著性，并據(jù)此對基因進(jìn)行了排序

，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?div id="d48novz" class="flower left">

，候選基因篩選可分為正向篩選和負(fù)向篩選，篩選指標(biāo)一般參考lfc（log2 fold change）和FDR（adjusted-pvalue）

，比如：根據(jù)lfc<-2且FDR<0.05進(jìn)行負(fù)向篩選

，lfc>2且FDR<0.05進(jìn)行正向篩選。

6.GSEA富集分析

對CRISPR篩選得到的候選基因進(jìn)行富集分析以了解基因的更多功能

，同時也可以對CRISPR篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證

，以便對潛在候選基因開展進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉燕飛. 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的HeLa細(xì)胞全基因組敲除文庫的建立及初步應(yīng)用[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2020.

[2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.

[3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.

[4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.

[5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.

[6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.