ceRNA：從全新的視角研究轉(zhuǎn)錄組(調(diào)控相關(guān)——lncRNA（學(xué)習(xí)總結(jié)）)

ceRNA：從全新的視角研究轉(zhuǎn)錄組

2016年09月15日訊 當(dāng)我們談到基因表達(dá)，自然離不開microRNA（miRNA）。這一類小小的非編碼RNA通過與mRNA目標(biāo)結(jié)合，抑制其翻譯成蛋白質(zhì)，從而在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化以及器官形成等過程中發(fā)揮重要作用。然而，事情并非如此簡(jiǎn)單。單個(gè)mRNA可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，而單個(gè)miRNA能夠調(diào)控多個(gè)mRNA。mRNA與miRNA之間的串?dāng)_（crosstalk）是如此復(fù)雜，又如此迷人，引無數(shù)學(xué)者競(jìng)折腰。

miRNA爭(zhēng)奪戰(zhàn)

2011年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的著名癌癥遺傳學(xué)家Pier Paolo Pandolfi教授在《Cell》雜志上提出假說，認(rèn)為不同類型的RNA分子會(huì)爭(zhēng)相與miRNA結(jié)合，從而減少miRNA對(duì)其mRNA目標(biāo)的抑制作用1。

換句話說，當(dāng)沒有競(jìng)爭(zhēng)性的轉(zhuǎn)錄本存在時(shí)，miRNA可能抑制翻譯或增強(qiáng)mRNA的降解。當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）上調(diào)時(shí)，ceRNA爭(zhēng)先恐后地與共同的miRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA翻譯的增加2。

這些競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA可能包括各種類型的RNA轉(zhuǎn)錄本，比如環(huán)狀RNA（circRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、假基因以及蛋白編碼mRNA。它們通過miRNA應(yīng)答元件（MRE）介導(dǎo)的“語(yǔ)言”來競(jìng)爭(zhēng)miRNA。根據(jù)假說，享有共同MRE的編碼和非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本能夠彼此積極地溝通，調(diào)節(jié)各自的表達(dá)水平。

自首次提出以來，Pier Paolo Pandolfi的假說就引起了科學(xué)界的轟動(dòng)。當(dāng)然，一些研究也對(duì)這一理論提出了質(zhì)疑。在一篇近期發(fā)表于《Nature Review Genetics》的文章中，澳大利亞Garvan醫(yī)學(xué)研究所的研究人員全面評(píng)估了支持和反對(duì)ceRNA假說的各項(xiàng)證據(jù)，以評(píng)估內(nèi)源性miRNA海綿的影響3。

分子機(jī)制

mRNA、假基因、lncRNA和circRNA都可以充當(dāng)ceRNA，阻止miRNA與蛋白編碼mRNA的相互作用。因此，這些ceRNA也能在ceRNA網(wǎng)絡(luò)中彼此調(diào)節(jié)。這種串?dāng)_的強(qiáng)度是由多個(gè)條件決定的，包括miRNA和目標(biāo)的相對(duì)水平、miRNA結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量，以及miRNA與目標(biāo)或ceRNA結(jié)合的強(qiáng)度。

mRNA作為ceRNA。在目前驗(yàn)證過的ceRNA中，大多數(shù)是mRNA，它們能夠競(jìng)爭(zhēng)miRNA的結(jié)合，從而調(diào)控基因表達(dá)。對(duì)于磷酸酶和張力蛋白同源基因（PTEN），一個(gè)推定的ceRNA是鋅指E盒結(jié)合同源框2（ZEB2）mRNA。研究證明，ZEB2 mRNA能夠隔離共享的miRNA而調(diào)控PTEN的表達(dá)。在人類黑色素瘤中，ZEB2表達(dá)的減弱導(dǎo)致抑癌基因PTEN被抑制?？傊?，蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本和編碼基因的3’ UTR可能作為miRNA的內(nèi)源性誘餌，從而調(diào)控miRNA的目標(biāo)，發(fā)揮重要的生物活性。

lncRNA作為ceRNA。隨著lncRNA的數(shù)量不斷增加，越來越多的研究也開始關(guān)注lncRNA在表觀遺傳機(jī)制及其他生物學(xué)過程中的作用。作為天然的miRNA誘餌，lncRNA有望在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控水平充當(dāng)ceRNA。比如，肌肉特異的lncRNA LINCMD1通過與miR-133和miR-135結(jié)合，調(diào)節(jié)了肌肉分化。這些miRNA通常負(fù)向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MAML1和MEF2C的表達(dá)。因此，LINCMD1作為miRNA誘餌，激活了MAML1和MEF2C。

假基因作為ceRNA。在轉(zhuǎn)錄組中，假基因也占了相當(dāng)大的比例。測(cè)序顯示，假基因內(nèi)的核苷酸序列得到了很好的保留，這表明可能存在選擇壓力來維持這些遺傳元件。假基因沒有內(nèi)含子，但與其祖先基因共享了5’和3’ UTR。過表達(dá)和RNAi實(shí)驗(yàn)證實(shí)，假基因PTENP1在轉(zhuǎn)錄后通過共享的miRNA調(diào)節(jié)了PTEN的表達(dá)。不過，目前只有極少數(shù)假基因經(jīng)過了功能驗(yàn)證，還需要更多的證據(jù)來支持。

circRNA作為ceRNA。到目前為止，研究最多的circRNA是性別決定Y（SRY）基因產(chǎn)生的，但這些環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能還不清楚。最近，SRY被確定為miR-138的海綿，具有ceRNA活性，表明這些環(huán)狀RNA可能在RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。circRNA已在多種類型的組織中被鑒定出，它們耐受RNase R的處理，且半衰期比線性RNA轉(zhuǎn)錄本更長(zhǎng)。因此，具有ceRNA活性的circRNA可能是串?dāng)_中的有效調(diào)節(jié)劑。

ceRNA與癌癥

其他研究已經(jīng)證明，ceRNA通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵癌基因或抑癌基因的表達(dá)，在癌癥發(fā)病中扮演重要的角色。

廣東醫(yī)學(xué)院的研究人員2015年在《Oncology Letters》上回顧了近期的研究，表明ceRNA在癌癥發(fā)展中起作用4。例如，編碼RNA和非編碼RNA（如lncRNA和假基因轉(zhuǎn)錄本）都可以充當(dāng)ceRNA，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖失控。

CDC42是一個(gè)參與細(xì)胞周期的基因，它抑制增殖、集落形成和腫瘤生長(zhǎng)。有人推測(cè)，CD44 mRNA和CDC42 mRNA競(jìng)相與miRNA結(jié)合。在上皮性卵巢癌中，CD44的表達(dá)上調(diào)讓CDC42 mRNA從抑制中釋放出來，從而導(dǎo)致結(jié)果向好的方向發(fā)展。與此相反，在Burkitt淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和前列腺癌中，CD44表達(dá)的下降伴隨著致癌轉(zhuǎn)化。

同樣地，HMGA2已被證明通過兩種機(jī)制促進(jìn)肺癌形成：作為蛋白編碼基因和非編碼RNA。HMGA2在轉(zhuǎn)移性肺腺癌中高表達(dá)，它促進(jìn)了癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移。另外，HMGA2通過與TGF-β共受體TGFβR3爭(zhēng)奪let-7，也促進(jìn)了肺癌形成。let-7激活了參與肺癌發(fā)展的TGF-β信號(hào)通路。

此外，ceRNA也在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中發(fā)揮作用。例如，假基因PTENP1與PTEN競(jìng)爭(zhēng)miRNA的結(jié)合，調(diào)節(jié)了特定miRNA目標(biāo)的去阻遏。PTENP1的缺失使得PTEN-miRNA結(jié)合增加，降低了PTEN的翻譯，從而導(dǎo)致腫瘤抑制功能減弱。PTENP1基因組拷貝數(shù)丟失的存在也支持了PTENP1是腫瘤抑制基因的假說。

調(diào)控相關(guān)——lncRNA（學(xué)習(xí)總結(jié)）

lncRNA現(xiàn)在這么紅并非沒有道理，它憑著自身強(qiáng)大而獨(dú)特的調(diào)節(jié)功能而撐起了細(xì)胞生命領(lǐng)域里的半邊天，而近年來與其相關(guān)的下游機(jī)制研究也是層出不窮。 lncRNA下游調(diào)節(jié)機(jī)制雖說是錯(cuò)綜復(fù)雜，但通常離不了基因、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后這五個(gè)層次。

1. 就基因水平而言，lncRNA與DNA甲基化間有著千絲萬縷的關(guān)系。 而這種模型常見于lncRNA和甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT1、3等）結(jié)合，并將該酶定位至基因的啟動(dòng)子（CpG島）以及甲基化，進(jìn)而抑制基因轉(zhuǎn)錄。

（ps.這一部分跟我之前看的m6A的書可以聯(lián)系上）

此外，位于核內(nèi)的lncRNA還可直接結(jié)合DNA序列，抑制轉(zhuǎn)錄過程；又或者結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶復(fù)合物以及通過組蛋白修飾來影響轉(zhuǎn)錄過程。 （組蛋白修飾可以作為單獨(dú)一門學(xué)科來研究）

而且lncRNA不僅能在核內(nèi)大展拳腳，因著自由穿梭核內(nèi)外的這份特性，它在胞漿內(nèi)也是鋒芒畢露。且不說大家耳熟能詳?shù)腸eRNA，lncRNA還可通過mRNA的可變剪切、定位以及穩(wěn)定性，來影響細(xì)胞內(nèi)生理功能的行使。

2.另外， lncRNA也會(huì)促進(jìn)pri-miRNA剪切 ，甚至有時(shí)其自身就親自客串為miRNA的前體 ，在被剪切為miRNA后，來抑制靶基因mRNA的表達(dá)水平。常言道，技多不壓身，一路開掛的lncRNA也順道插手了蛋白翻譯過程，要么結(jié)合mRNA 5’UTR,促進(jìn)翻譯；要么結(jié)合特定蛋白，靶向mRNA,抑制翻譯；要么仰仗著sORF翻譯多肽來自產(chǎn)自銷。

lncRNA如此全能，也讓蛋白質(zhì)心癢不已。兩者一拍即合，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾、定位等都在lncRNA的影響下有條不紊的進(jìn)行著。

盡管以上種種就是lncRNA發(fā)揮功能的十八般武藝，但仍要謹(jǐn)記貪多嚼不爛，小伙伴們只需依據(jù)lncRNA的亞細(xì)胞定位（與調(diào)節(jié)功能有關(guān)）擇其一認(rèn)真練之，就必然會(huì)有所收獲。

1.定位核內(nèi)，先考慮附近100萬bp內(nèi)的基因表達(dá)是否有影響，有則為cis-順式作用;反之，為trans-反式調(diào)控基因，就可依據(jù)RNA pulldown篩選與lncRNA結(jié)合的蛋白；

2.定位胞漿內(nèi)，若結(jié)合RNA，首選ceRNA；若結(jié)合蛋白，則可考慮mRNA可變剪切、穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)基因翻譯以及蛋白修飾等機(jī)制。

3.而就lncRNA分子機(jī)制研究的總體而言，始終是有兩個(gè)主要策略貫徹其中。

1.? 以非編碼RNA為對(duì)象入手，這是非編碼RNA研究的常規(guī)套路。 從不同刺激或處理的轉(zhuǎn)錄組或表達(dá)組入手，先通過差異倍數(shù)和顯著性，及非編碼RNA的基因組定位信息等篩選功能性候選RNA分子；再通過正反功能以及細(xì)胞-動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二次驗(yàn)證。

該策略穩(wěn)定可靠，風(fēng)險(xiǎn)性較小，而難點(diǎn)在于后期分子機(jī)制的研究上，若只涉及明星通路及相關(guān)蛋白，則是探討了lncRNA的間接分子機(jī)制；但要想將文章拔高檔次，還需以RNA-pulldown，RIP，ChIRP等實(shí)驗(yàn)技術(shù)確定lncRNA相互作用分子以及作用結(jié)合位點(diǎn)，來挖掘lncRNA的直接分子機(jī)制。

2.? 從某一個(gè)分子作用模式入手，恰恰反其道而行之。 先靶向一個(gè)重要的蛋白分子，比如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、酶類或者轉(zhuǎn)錄因子等；或者一個(gè)細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)，如線粒體、外泌體等，通過RIP-seq或者RNA-seq檢測(cè)其結(jié)合的或者包含的RNA，按照富集的倍數(shù)和顯著性篩選候選RNA分子，后面通過siRNA或者高表達(dá)的方法篩選功能RNA。

該策略從課題設(shè)計(jì)開始就有著明確指向的功能分子機(jī)制，在后續(xù)的分子機(jī)制研究中比較方便展開；但難點(diǎn)是前期如何做好RIP-seq和細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的有效分離，這是后續(xù)實(shí)驗(yàn)可靠性和可行性的重要保障。

兩種策略在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上有部分重疊，但也有各自獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)技術(shù)需求或數(shù)據(jù)分析策略。 不同策略適應(yīng)于不同的課題和實(shí)驗(yàn)室背景，在選擇的時(shí)候可以根據(jù)課題特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)體系進(jìn)行取舍。當(dāng)然，兩種策略也可以同時(shí)應(yīng)用，相得益彰，相互作證，起到更好驗(yàn)證效果。

插入我十分珍藏的一張RNA之間的互作關(guān)系來收尾

再附贈(zèng)多組學(xué)RNA研究的文章一篇：

https://doi.org/10.1155/2020/1618527

這篇帖子以解螺旋一篇文章作為框架，為表尊重，附上鏈接? ? https://www.sohu.com/a/206407974_170798

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