用RNA-seq快速繪制大腦圖

2016年09月14日訊 在過去的十年中，DNA和RNA測序技術(shù)已迅猛發(fā)展并且更加便宜，現(xiàn)在它們被運用到各種新的領(lǐng)域中。最近在《Neuron》發(fā)表的一項新研究中，研究人員使用RNA測序技術(shù)，在單個神經(jīng)元水平上繪制小鼠的大腦圖。這種新技術(shù)被稱為Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing （MAPseq），可能比目前的方案更快和更容易。

這項研究的第一作者、冷泉港實驗室Anthony Zador教授的研究生Justus Kebschull說：“有了MAPseq，我們試圖查明單個神經(jīng)元最終到達(dá)哪里?！盳ador的團隊積極開發(fā)MAPseq，因為缺乏高通量方法來跟蹤單個神經(jīng)元。

在這項新的研究中，研究人員向一個選定的腦區(qū)，注射了一種含有大量RNA分子的失活病毒。每個RNA分子都有其獨特的“條碼”序列，每一個都在一個神經(jīng)元中結(jié)束，并通過軸突。幾天之后，研究人員解剖大腦，收集和測定來自不同腦區(qū)的RNA條形碼。

通過將來自注射腦區(qū)與其他腦區(qū)的RNA條碼進(jìn)行匹配，研究人員可以追蹤單個神經(jīng)元最終到達(dá)哪里。Kebschull說：“這是利用測序和條形碼用于高通量神經(jīng)解剖學(xué)的第一個例子?！?/p>

快速地映射連接

弄清神經(jīng)元是如何連接的，是理解大腦如何運作的一個重要組成部分。Kebschull說：“如果你認(rèn)為大腦就像一臺計算機，我們就需要知道什么與什么連接在了一起，比如硬盤是否連接到了處理器?！?/p>

在目前的許多腦成像技術(shù)中，研究人員都是在神經(jīng)元中表達(dá)一種熒光標(biāo)記，并用顯微鏡觀察哪些大腦區(qū)域發(fā)光。但是Kebschull說：“每一個腦區(qū)有數(shù)千個神經(jīng)元?！边@些“批量跟蹤”方法不能區(qū)分單個神經(jīng)元，因此，研究人員無法區(qū)分兩個源神經(jīng)元最終到了同一區(qū)域，還是不同的區(qū)域。這是重要的信息?！安煌纳窠?jīng)元可能具有不同的屬性，并可能攜帶不同的信息。”

其他的腦成像技術(shù)可以跟蹤單個神經(jīng)元，但這些方法都是勞動密集型的和費時的。Kebschull說：“跟蹤一個單一的神經(jīng)元需要數(shù)周的時間。如果你想研究成千上萬個神經(jīng)元，你基本上完蛋了?！毕喾?，MAPseq用了一個星期的時間，就繪制出了一個注射腦區(qū)的幾千個神經(jīng)元圖，速度發(fā)生了一千倍的提升。

Zador和他團隊的靈感來自以前的腦成像技術(shù)，如Brainbow，研究人員隨機表達(dá)熒光標(biāo)記物來標(biāo)記不同的神經(jīng)元，具有各種各樣多種的顏色。但使用顯微鏡能夠容易區(qū)分的顏色數(shù)量有限，出于實際的目的，研究人員在這些模型中一次可以至多跟蹤10個神經(jīng)元。

Kebschull說：“有了MapSeq，我們考慮從顏色切換到隨機核酸序列。”利用核酸條碼序列，將提供更多樣化的標(biāo)志物，使用目前的高通量測序方法，這些可能是非常快速和相對便宜的讀數(shù)。從30個核酸序列的一段序列開始，研究人員將最終獲得1018個可能的序列，是小鼠大腦中神經(jīng)元數(shù)量的10個數(shù)量級以上。

在2012年，Zador首次建議使用條碼測序用于高通量的大腦映射，那么，研究人員必須弄清技術(shù)細(xì)節(jié)。他們決定使用一種無效的Sindbis病毒--在神經(jīng)科學(xué)中常用的一種工具，來將條碼RNA序列運送到小鼠的神經(jīng)元中。但他們馬上遇見了一種并發(fā)癥。

Kebschull說：“人們認(rèn)為是非復(fù)制型的病毒，其實是復(fù)制型的。”因此，病毒粒子傳播超越了初級感染的神經(jīng)元，來標(biāo)記其他神經(jīng)元，這將使得映射分析變得復(fù)雜化。對于新技術(shù)，Kebschull制備了一種重組Sindbis病毒，能感染神經(jīng)元，但不傳播，為進(jìn)一步改進(jìn)鋪平了道路。

一旦RNA條碼進(jìn)入神經(jīng)元，研究人員必須確保它們沿軸突運輸?shù)剿鼈兊慕K端。為此，他們添加了一種工程化的蛋白質(zhì)，并表明它能有效地工作。此外，研究人員希望確保每個標(biāo)記的神經(jīng)元收到一個獨特的條碼，并且他們計算了必須注入多少病毒，才能實現(xiàn)這一目標(biāo)。Kebschull和Zador也弄清了如何用高通量測序準(zhǔn)確地識別條形碼。

測試技術(shù)

Zador的團隊在小鼠大腦藍(lán)斑（LC）的一部分中測試了MAPseq，這個腦區(qū)是一種激素去甲腎上腺素的來源。去甲腎上腺素可調(diào)節(jié)警覺性和專注力，來自LC的神經(jīng)元是否延伸整個皮質(zhì)或只到達(dá)特定區(qū)域，尚不明確。Kebschull說：“LC是一個很好的測試案例?！?/p>

使用MAPseq，研究人員發(fā)現(xiàn)從LC神經(jīng)元投射出許多各種各樣的圖案，一些神經(jīng)元到達(dá)一個特定的靶標(biāo)，其他神經(jīng)元則伸展的更廣泛。因此，來自LC的去甲腎上腺素可以到達(dá)整個皮質(zhì)，以及在特定區(qū)域有更嚴(yán)重的影響，這與以前的研究結(jié)果一致。

目前的研究只使用一種病毒注射到LC，Zador和他的團隊正在努力增加尋找其他病毒。最終，他們希望利用MAPseq同時跟蹤整個皮層的神經(jīng)元。Kebschull說：“我們正在擴大這種方法，以開展更多的高通量神經(jīng)解剖學(xué)。”研究人員還計劃在不同疾病的小鼠模型中使用MAPseq?！拔覀兛梢匝芯坎煌淖蚤]癥或發(fā)育疾病小鼠模型，以探析大腦的連接是如何錯誤的?！?/p>

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