2016年09月06日訊 過去10年里誕生了兩種非常有用的生物學(xué)工具，第一個就是人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），這是一項(xiàng)榮獲諾貝爾獎的先進(jìn)科技產(chǎn)物
，2006年時研究者開始對小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，隨后在人類機(jī)體中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究者表示他們有可能將成體的皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為多能干細(xì)胞，隨后這些多能干細(xì)胞就能夠被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成為任何類型的細(xì)胞，這些細(xì)胞是個體基因組在細(xì)胞尺度的化身，而且其可以幫助科學(xué)家開發(fā)出那些不能取自活體的細(xì)胞類型，ipsCs通常能夠提供方法來模仿單成因及復(fù)雜的人類疾病，同時還可以指導(dǎo)進(jìn)行基于細(xì)胞的療法。第二項(xiàng)工具就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)
，其能夠?qū)蚪M中的任何區(qū)域進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯，當(dāng)涉及傳統(tǒng)永生的細(xì)胞系，比如HeLa或HEK293細(xì)胞系時，利用CRISPR進(jìn)行切割或許會作為一個新手讓研究者學(xué)習(xí)數(shù)周，第二波基于CRISPR的方法常常是通過增強(qiáng)或者減弱基因表達(dá)的水平來發(fā)揮作用的，而不是進(jìn)行基因的切割編輯人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞.png)
上述兩種技術(shù)的結(jié)合或?qū)聿豢晒懒康男?yīng)
盡管CRISPR-Cas9和人類iPSCs已經(jīng)成為研究者在實(shí)驗(yàn)室中老生常談的話題了，但對兩者進(jìn)行統(tǒng)一卻并不容易
最基本的工作流程
編輯且控制人類iPSCs細(xì)胞中的基因表達(dá)往往以兩條平行的工作流開始
人類多能干細(xì)胞VS人類腫瘤細(xì)胞系
首先研究者在人類癌細(xì)胞系中嘗試CRISPR-Cas9工具，當(dāng)他們準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移到研究人類多能干細(xì)胞時
開始了解我們的基因
研究者表示
選擇多種導(dǎo)向RNAs并且對其進(jìn)行檢測
敲除VS精確編輯
當(dāng)利用CRISPR-Cas9切割基因時
目前研究者Hockemeyer及其同事正在開發(fā)新型策略來使得同源性直接修復(fù)發(fā)揮主要作用
研究者Conklin的團(tuán)隊(duì)開發(fā)出了一種快速的數(shù)字PCR技術(shù)
對切割進(jìn)行特性描述
在細(xì)胞分化前和分化后
此外研究者還抽取了基因編輯的基因組進(jìn)行調(diào)查
脫靶效應(yīng)
一種抑制脫靶編輯的主要方法就是至少利用兩種或多種靶向作用相同位點(diǎn)的不同“向?qū)А保@或許并不可能給出相同的脫靶結(jié)果
控制基因的表達(dá)而不是對基因進(jìn)行編輯
如果希望對多能干細(xì)胞中對多能性表現(xiàn)非常重要的基因進(jìn)行敲除的話，很明顯我們的運(yùn)氣并不夠好
近來一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)
，對ipsCs篩查尋找功能缺失區(qū)域時，相比CRISPR-Cas9而言，CRISPRi或許會比傳統(tǒng)的CRISPR更加有效，CRISPRi能夠沉默95%的細(xì)胞中的基因表達(dá)，而CRISPR-Cas9僅能夠沉默60%至70%細(xì)胞中基因的表達(dá)，這是因?yàn)镃RISPR-Cas9并不總是會引發(fā)移碼突變，而移碼突變通常會使得蛋白質(zhì)部分或完全失去功能，也就是說，成功地沉默基因的表達(dá)往往因細(xì)胞類型和位點(diǎn)不同而不同。基因表達(dá)控制和基因編輯之間的主要差異就是，在基因表達(dá)控制下
對于研究者而言
根據(jù)新聞報道
，第一項(xiàng)測試人體內(nèi)基因編輯技術(shù)CRISPR的研究即將在美國展開。根據(jù)美聯(lián)社報道，該研究計(jì)劃使用CRISPR治療導(dǎo)致失明的遺傳性眼部疾病。
的人這種情況有一個基因突變
，影響視網(wǎng)膜的功能，視網(wǎng)膜是眼睛后部的感光細(xì)胞，對正常視力至關(guān)重要。這種情況是Leber先天性黑蒙的一種形式，據(jù)美國國家衛(wèi)生研究院稱，兒童失明最常見的原因之一，每10萬名新生兒中就有2至3名會受到影響。
這種治療方法將使用CRISPR來糾正突變
，CRISPR是一種讓研究人員能夠精確編輯DNA的工具美聯(lián)社報道，在一個特定的地點(diǎn)，
的研究人員將使用一種注射劑將治療直接傳遞到感光細(xì)胞
，根據(jù)Editas Medicine公司的一份聲明，Editas Medicine公司正在與Allergan一起進(jìn)行這項(xiàng)研究。這項(xiàng)試驗(yàn)將總共招收18名患者
，兒童（3歲及以上）和成人。這項(xiàng)新研究不同于中國科學(xué)家去年用CRISPR編輯雙胞胎嬰兒基因組的有爭議的研究。美聯(lián)社報道
，在這種情況下，這位中國科學(xué)家編輯了胚胎的DNA，這些基因改變可能會遺傳給下一代。美聯(lián)社說，在這項(xiàng)新的研究中，在兒童和成人身上進(jìn)行的DNA編輯不能傳給他們的后代。科學(xué)家們剛剛用CRISPR解開人類基因組做了10件令人驚奇的事情：仿生人類的6個分子里程碑：最初發(fā)表在《生命科學(xué)》上的十大技術(shù)
。簡述crisprcas9的原理和用途如下：
CRISPR-Cas9技術(shù)原理：CRISPR-Cas9技術(shù)包含兩種重要的組分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白
，而另一種則是具有導(dǎo)向功能的gRNACRISPR-Cas9用途：利用兩種修復(fù)機(jī)制
，可以實(shí)現(xiàn)基因的插入和敲除。沒有模板的情況下，利用NHEJ修復(fù)，隨機(jī)插入或缺失序列造成基因敲除。有模板存在的情況下，可通過HDR修復(fù)在剪切位點(diǎn)引入目的修飾基因，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)修改。
主要功能
CRISPR-Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA
。而CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)也是用于基因編輯中前沿的方法。以CRISPR-Cas9基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在一系列基因治療的應(yīng)用領(lǐng)域都展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景
，例如血液病、腫瘤和其他遺傳疾病。該技術(shù)成果已應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾。
專利授權(quán)
2014年4月15日
，獲得了美國專利與商標(biāo)局關(guān)于CRISPR的第一個專利授權(quán)。專利權(quán)限包括在真核細(xì)胞或者任何細(xì)胞有細(xì)胞核的物種中使用CRISPR。這意味著擁有在除細(xì)菌之外的所有生物，包括老鼠、豬和人身上使用CRISPR的權(quán)力。CRISPR Cas9 -- C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats CRISPR- A ssociated P roteins 9
Crispr-CAS9系統(tǒng)最初在細(xì)菌和古生菌中觀察到
，作為一種適應(yīng)性微生物免疫系統(tǒng)，提供對外來病毒和質(zhì)粒的獲得性免疫；已測序物種中，40%的細(xì)菌和90%的古生菌可觀察到CRISPR基因座，且細(xì)菌中可能存在一個以上的基因座入侵的外來DNA被Cas核酸酶切割
文獻(xiàn)中已描述45個不同的cas蛋白家族，每一個家族在合成cRNA
內(nèi)切酶是化膿性鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌CAS9核酸酶蛋白
gRNA是一種工程化的單鏈嵌合體RNA
，結(jié)合了細(xì)菌tracrRNA的支架功能和細(xì)菌crRNA的特異性。gRNA 5'端的最后20bp作為一個歸位裝置，通過RNA-DNA堿基配對，將CAS9/GRNA復(fù)合物招募到PAM(protospacer adjacent motif )上游特定的DNA靶位。不同菌株和不同類型的CRISPR-Cas蛋白之間的PAM序列不同，化膿性鏈球菌Cas9的序列是5’-NGG。目前的CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以直接用于任何5’-N20-NGG DNA序列，并產(chǎn)生精確的雙鏈斷裂。然后，通過在幾乎所有細(xì)胞類型和生物體中發(fā)現(xiàn)的兩種通用修復(fù)機(jī)制修復(fù)DSB：非同源末端連接（NHEJ；the non-homologous end-joining ）或同源定向修復(fù)（HDR；the homology-directed repair）。NHEJ修復(fù)路徑是一種容易出錯的修復(fù)機(jī)制
除NHEJ
CRISPR-CAS9系統(tǒng)可以通過gRNA的設(shè)計(jì)針對任何基因組區(qū)域的特異性取決于位于目標(biāo)序列下游的PAM序列。作為細(xì)菌和古細(xì)菌免疫系統(tǒng)
PAM識別序列因來源于CAS9核酸酶的細(xì)菌種類和類型而異
Table 1 : PAM Sequences from Different Species and Subtypes of Cas Nucleases.
Cas9 Nickase是Cas9的一種突變形式
為了利用Cas9 Nickase進(jìn)行基因組編輯
如果共同引入含有所需修飾的修復(fù)模板DNA與gRNA和Cas9 nickase
Table 2 : Cas9 Nickase and Nuclease Usage in Gene Disruption and Specific Gene Modification
Cas9雙突變體或Null突變體是通過突變野生型Cas9的兩個切割結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生的
Table 3 : Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases
large size and G-rich PAM sequence
Cpf1于2015年底由麻省理工學(xué)院的Feng Zhang小組發(fā)現(xiàn)
Cpf1允許新的定位可能性
Cpf1需要較短的guide RNA才能運(yùn)作
另一個顯著差異是Cas9在切割后產(chǎn)生平端，而Cpf1留下可用于定向克隆的粘性5'突出端
Cpf1切割PAM位點(diǎn)下游18-23bp的DNA
雖然化膿性鏈球菌Cas9（S. pyogenes Cas9; spCas9）是最常用的CRISPR核酸酶
，但最近的注意力已轉(zhuǎn)向從金黃色葡萄球菌中分離的微型Cas9核酸酶（S. aureus; saCas9）。這種小核酸酶通過使生物體內(nèi)基于CRISPR的基因編輯更加可行，具有改變生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)業(yè)的巨大潛力。 SaCas9和spCas9能夠以相當(dāng)?shù)男试隗w內(nèi)切割真核DNA。但saCas9具有幾個特性，使其對某些應(yīng)用更有用。SaCas9比spCas9小約1kb
，使其能夠更有效地包裝到較小容量的腺相關(guān)病毒（AAV）中，為調(diào)控元件，crRNAs和tracrRNAs留下額外空間。通過將Cas9和sgRNA包含在一個構(gòu)建體（稱為All-In-One載體）中，可以在一個轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟中完成Cas9表達(dá)和sgRNA靶向。由于其低免疫原性和選擇性感染某些組織類型的能力，AAV是用于體內(nèi)研究的優(yōu)選基因遞送方法。同樣
saCas9較長的PAM的一個缺點(diǎn)是
麻省理工學(xué)院張實(shí)驗(yàn)室于2015年進(jìn)行的一項(xiàng)研究調(diào)查了體內(nèi)saCas9的表現(xiàn)。 他們將攜帶saCas9的AAV注射到小鼠體內(nèi)以破壞PCSK9基因
，該基因與家族性高膽固醇血癥有關(guān)。 這導(dǎo)致1周后肝組織中基因修飾> 40％，注射后4周沒有毒性跡象。 最近的其他工作已經(jīng)用于開發(fā)具有使用分子進(jìn)化的松弛PAM識別特異性的變體saCas9。 與野生型saCas9相比，這種變體允許更大范圍的潛在編輯目標(biāo)，同時保留其小尺寸傳達(dá)的優(yōu)勢。 鋅指核酸酶（Zinc-finger Nucleases; ZFNs）
轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases; TALENs）
Table 4 : Comparison of current genome editing technologies
An Intro to CRISPR Cas9
6月11日
，頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》（Nature）子刊《自然-醫(yī)學(xué)》（Nature Medicine） 同時發(fā)表了兩篇新成果，給持續(xù)受到追捧的“基因魔剪” CRISPR技術(shù)潑了冷水。來自瑞典卡洛林斯卡研究所和劍橋諾華生物醫(yī)學(xué)研究院的兩個研究團(tuán)隊(duì)分別將關(guān)注點(diǎn)投到了一處：CRISPR編輯成功或增加患癌風(fēng)險。
兩個團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，CRISPR/Cas9基因編輯過程中造成的DNA雙鏈斷裂
，會激活p53蛋白通路，引起人多能干細(xì)胞的凋亡。反過來也就是說，經(jīng)基因編輯后還能存活下來的細(xì)胞，通常存在p53功能缺陷。?
p53缺陷是至今已知的與癌癥相關(guān)的最普遍的基因突變
CRISPR技術(shù)的安全性再次受到質(zhì)疑后
，首當(dāng)其沖的是幾家基因編輯領(lǐng)域內(nèi)的公司。Editas Medicine、Intellia Therapeutics、CRISPR Therapeutics這三家在紐約納斯達(dá)克上市的公司， 6月11日當(dāng)天股票均大幅下挫
增加患癌風(fēng)險
此前的研究發(fā)現(xiàn)
CRISPR Therapeutics首席執(zhí)行官Sam Kulkarni此番也表示，該研究結(jié)果看起來是有道理的
。并表示，這是我們該重視的地方，尤其是目前 CRISPR 療法被應(yīng)用于越來越多的疾病中。我們要確保這些編輯過的細(xì)胞不會在回輸體內(nèi)后成為癌細(xì)胞。來源：澎湃新聞網(wǎng)
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