Cell,Res：CRISPR/Cas9瞬時表達(dá)基因組編輯體系

2016年09月05日訊 基因組編輯技術(shù)是最新發(fā)展起來的植物基因功能研究及定向育種的重要手段。在植物中實現(xiàn)基因組編輯的常規(guī)方法是將序列特異性核酸酶（如CRISPR/Cas9）的編碼DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)而實現(xiàn)對目的基因的定點編輯。這種情況下，CRISPR載體整合在植物染色體中，需通過后代分離獲得不含CRISPR/Cas9 DNA的植株。由于此過程涉及轉(zhuǎn)基因植物，因此生物安全性可能會受到一定的質(zhì)疑；同時，CRISPR/Cas9 DNA的穩(wěn)定表達(dá)會增加脫靶以及嵌合體發(fā)生的概率。此外，對于轉(zhuǎn)化困難的植物基因型、物種和營養(yǎng)繁殖的植物，這種基于植物穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的基因組編輯技術(shù)路線就暴露其局限性。

為了解決這些問題，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組在植物中率先建立了基于CRISPR/Cas9瞬時表達(dá)的基因組編輯體系。該研究通過CRISPR/Cas9 DNA或RNA瞬時表達(dá)，對六倍體小麥及四倍體小麥的7個不同基因進(jìn)行了定點敲除，突變效率為1.0%-9.5%，且在T0代得到了不含外源基因的小麥純合敲除突變體。瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)體系與常規(guī)的基因組編輯技術(shù)體系的定向突變效率相似。

對突變體植物中32個潛在脫靶位點進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9 DNA或CRISPR/Cas9 RNA獲得的突變體中均未發(fā)生脫靶效應(yīng)，證明這兩種方法具有更高的特異性。通過瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)體系獲得的突變能穩(wěn)定遺傳，純合突變體表現(xiàn)出相應(yīng)的預(yù)期表型。

這一瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)體系的建立，將會大大提高基因組編輯在植物中的生物安全性并促進(jìn)基因組編輯在植物中的應(yīng)用。尤其是瞬時表達(dá)CRISPR/Cas9 RNA的方法，由于整個基因組編輯過程中不涉及外源DNA，將有助于生物安全植物基因組編輯育種的進(jìn)程。高彩霞研究組博士生張毅、梁振、宗媛為該論文的并列第一作者，相關(guān)研究得到基金委、中科院、農(nóng)業(yè)部及科技部的資助。

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