CRISPR先驅(qū)Cell子刊發(fā)表新成果

2016年09月05日訊 細菌利用CRISPR RNA（crRNAs）指導(dǎo)的監(jiān)視復(fù)合體，來靶定要破壞的外源核酸。雖然大多數(shù)I型和III型CRISPR系統(tǒng)需要四個或更多的不同蛋白質(zhì)，才能形成多亞基的監(jiān)視復(fù)合體，但是，I-C型系統(tǒng)只使用三個蛋白質(zhì)來實現(xiàn)crRNA成熟和雙鏈DNA的靶標(biāo)識別。

9月1日，Cell子刊《Molecular Cell》在線發(fā)表的一項研究中，加州大學(xué)伯克利分校的研究團隊表明，上述每個蛋白質(zhì)都發(fā)揮著多重的功能和結(jié)構(gòu)作用：Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向?qū)?，以用于?jīng)由Cas8c的DNA結(jié)合和解旋。研究人員采用冷凍電子顯微鏡技術(shù)，獲得了Cascade/I-C 監(jiān)視復(fù)合體的自由形式和DNA結(jié)合形式的重建結(jié)構(gòu)，所揭示的構(gòu)象變化可使得形成R環(huán)，每一條DNA鏈都有不同的定位。這種精簡的I-C型系統(tǒng)解釋了CRISPR通路如何可能進化出結(jié)構(gòu)緊湊，保留其作為RNA引導(dǎo)性DNA捕獲平臺的全部功能。

這篇論文的通訊作者是基因組編輯技術(shù)變革的先驅(qū)之一Jennifer A. Doudna教授，她曾因這一技術(shù)獲得了“生命科學(xué)突破獎”（ Breakthrough Prize）（欲戴王冠，必承其重：追尋CRISPR奧秘的女科學(xué)家），同時也是CRISPR專利的有力競爭者（CRISPR發(fā)明專利究竟花落誰手？）。

Doudna帶領(lǐng)的研究團隊取得了諸多令人側(cè)目的CRISPR研究成果。去年十月，Doudna及其同事在Nature雜志上發(fā)表文章指出，Cas9 的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象狀態(tài)直接控制了DNA切割活性。他們通過分子內(nèi)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實驗，鑒定了HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的一種激活構(gòu)象。研究還證實，一個α-螺旋將HNH的構(gòu)象改變傳達給RuvC結(jié)構(gòu)域，激活它實現(xiàn)DNA切割。

今年年初，Doudna團隊揭示了CRISPR-Cas9準(zhǔn)備剪切DNA時的關(guān)鍵分子結(jié)構(gòu)。在CRISPR-Cas系統(tǒng)中，Cas蛋白與小CRISPR RNA（crRNA）形成復(fù)合體，切割與RNA互補的外源DNA。R-loop是I型和 II型CRISPR-Cas的一個典型特征，基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用，研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結(jié)構(gòu)。

四月份，Doudna團隊在細菌中發(fā)現(xiàn)了一種CRISPR相關(guān)的非經(jīng)典Argonaute。Argonaute蛋白是真核生物RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)子，它也參與了原核生物的基因組防御。Doudna及其同事證實，CRISPR相關(guān)Argonaute具有與眾不同的特異性。

五月份，Doudna團隊在Molecular Cell雜志上發(fā)表文章，揭示了CRISPR介導(dǎo)免疫記憶的一個重要機制。已知CRISPR-Cas的外源序列插入受到嚴格調(diào)控，整合在CRISPR前導(dǎo)序列（富含AT）的末尾。Doudna及其同事發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌E. coli獲取外源序列需要蛋白IHF（integration host factor）。IHF結(jié)合前導(dǎo)序列并且誘導(dǎo)DNA彎曲，允許Cas1-Cas2整合酶催化外源序列插入。這項研究表明，CRISPR前導(dǎo)序列在外源序列捕獲中起到了重要的作用。

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