基因測(cè)序那些事

2016年08月31日訊 狹義上講，測(cè)序就是指利用技術(shù)手段確定一段核糖核酸或脫氧核糖核酸里面的堿基順序，例如DNA中的ATCG如何排列。廣義上的測(cè)序不僅需要確定DNA中的ATCG堿基順序，還包括這些堿基與整個(gè)基因組的關(guān)系，堿基變化給個(gè)體帶來(lái)的有利或有害的影響。

最早的時(shí)候，基因測(cè)序只能應(yīng)用于科研之上，是遺傳學(xué)及分子生物學(xué)一個(gè)重要的科研工具。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序價(jià)格大大降低及測(cè)序儀的能力越來(lái)越高，測(cè)序技術(shù)應(yīng)該不僅僅局限于科研市場(chǎng)，越來(lái)越多的人想要將測(cè)序這種分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到面向大眾的普通消費(fèi)市場(chǎng)，特別是醫(yī)療市場(chǎng)和臨床市場(chǎng)，一旦測(cè)序技術(shù)在這些市場(chǎng)進(jìn)行推廣應(yīng)用，將會(huì)帶來(lái)更大的發(fā)展。

狹義上講，測(cè)序就是指利用技術(shù)手段確定一段核糖核酸或脫氧核糖核酸里面的堿基順序，例如DNA中的ATCG如何排列。廣義上的測(cè)序不僅需要確定DNA中的ATCG堿基順序，還包括這些堿基與整個(gè)基因組的關(guān)系，堿基變化給個(gè)體帶來(lái)的有利或有害的影響。

一般現(xiàn)在市場(chǎng)上的測(cè)序分為兩種，研究性測(cè)序：對(duì)某個(gè)物種的基因組圖譜進(jìn)行測(cè)序或者針對(duì)某個(gè)疾病的群體進(jìn)行整體序列研究；應(yīng)用性測(cè)序：測(cè)定個(gè)人基因組對(duì)疾病等進(jìn)行預(yù)測(cè)。

為什么現(xiàn)在還需要不斷的測(cè)序：

首先是遺傳信息是所有物種的遺傳基礎(chǔ)，所有表型都是遺傳和環(huán)境的共同作用，但遺傳是根本，環(huán)境是起影響作用；遺傳信息里，作為大多數(shù)物種遺傳物質(zhì)的DNA當(dāng)然應(yīng)該首要關(guān)注，所以需要對(duì)物種的基因組進(jìn)行測(cè)定。地球上如此多的物種，目前尚有大量物種未被測(cè)序，所以還一直進(jìn)行測(cè)序。

同一物種的個(gè)體，是有異質(zhì)性，也就是有個(gè)體差異的，正因?yàn)檫@種差異，才會(huì)有進(jìn)化，對(duì)有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種也才有育種的可能。所以，這就要對(duì)同一物種不同個(gè)體（即群體）進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序規(guī)模越大，所能發(fā)現(xiàn)的有趣基因越多。

健康診斷，目前已經(jīng)有分子診斷、基因診斷，而基因組診斷則是更全面，更本質(zhì)的診斷，所以將來(lái)會(huì)出現(xiàn)人人基因組的局面，那時(shí)會(huì)測(cè)定每個(gè)人的基因組，依據(jù)個(gè)人特點(diǎn)的基因組進(jìn)行健康管理、疾病治療或指導(dǎo)用藥。

測(cè)序方法：

一代測(cè)序：

即Sanger測(cè)序法，核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 種單脫氧核苷三磷酸（dNTP，其中的一種用放射性P32標(biāo)記）存在條件下復(fù)制時(shí)，在四管反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），因?yàn)殡p脫氧核苷沒(méi)有3’-OH，所以只要雙脫氧核苷摻入鏈的末端，該鏈就停止延長(zhǎng)，若鏈端摻入單脫氧核苷，鏈就可以繼續(xù)延長(zhǎng)。如此每管反應(yīng)體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3’端的一系列長(zhǎng)度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個(gè)泳道進(jìn)行凝膠電泳，分離長(zhǎng)短不一的核酸片段，長(zhǎng)度相鄰的片段相差一個(gè)堿基。經(jīng)過(guò)放射自顯影后，根據(jù)片段3’端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。

二代測(cè)序（NGS）：

將基因組DNA打碎成約100-200個(gè)堿基的小片段，在片段的兩個(gè)末端加上接頭 （ adapter ）。將DNA片段變成單鏈后通過(guò)接頭與芯片表面的引物堿基互補(bǔ)而使一端被固定在芯片上。另外一端隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成橋狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)30輪擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)單分子被擴(kuò)增大約1000 倍，成為單克隆的DNA簇，隨后將DNA 簇線性化。在下一步合成反應(yīng)中，加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。在DNA合成時(shí)，每一個(gè)核苷酸加到引物末端時(shí)都會(huì)釋放出焦磷酸鹽，激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反應(yīng)板表面，在讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類后，將這些熒光基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3’端黏性，隨后添加第二個(gè)核苷酸。如此重復(fù)直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果， 就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列。

三代測(cè)序：

DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記4種堿基（dNTP），在堿基配對(duì)階段，不同堿基的加入，會(huì)發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。同時(shí)這個(gè) DNA 聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一，讀長(zhǎng)主要與酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是將反應(yīng)信號(hào)與周圍游離堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來(lái)。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：在一個(gè)反應(yīng)管（SMRTCell：?jiǎn)畏肿訉?shí)時(shí)反應(yīng)孔）中有許多這樣的圓形納米小孔，即 ZMW（零模波導(dǎo)孔）外徑 100多納米，比檢測(cè)激光波長(zhǎng)?。〝?shù)百納米），激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū)，能量被限制在一個(gè)小范圍里，正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分，使得信號(hào)僅來(lái)自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域，孔外過(guò)多游離核苷酸單體依然留在黑暗中，從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。

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