CRISPR基因編輯系統(tǒng)的最新研究成果

CRISPR基因編輯系統(tǒng)的最新研究成果

2016年08月31日訊 最近，科學(xué)家們利用CRISPR-Cas9首次讓人細(xì)胞變身為記憶存儲(chǔ)系統(tǒng)，有望靶向清除多種皰疹病毒感染和用于治療血液疾病，直接改變細(xì)胞身份，高效和特異性地實(shí)現(xiàn)靶DNA單堿基突變等等。更為重要的是，我國科學(xué)家將進(jìn)行世界首個(gè)人類CRISPR基因編輯臨床試驗(yàn)。

CRISPR基因編輯技術(shù)或有望治療血液疾病

刊登于國際著名雜志Nature Medicine上的一項(xiàng)研究報(bào)告中，來自圣猶大兒童研究醫(yī)院的研究人員通過研究利用CRISPR基因編輯技術(shù)就可以幫助治療鐮刀形細(xì)胞病以及β地中海貧血癥，該研究為后期通過基因組編輯技術(shù)來開發(fā)治療常見血液障礙的新型療法提供了一定幫助。

研究者M(jìn)itchell J. Weiss說道，我們所利用的基因編輯方法對(duì)于治療遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在癥具有一定益處，我們很早就知道，機(jī)體中胎兒血紅蛋白水平持續(xù)升高，且攜帶遺傳突變的個(gè)體往往對(duì)鐮刀形細(xì)胞病及β地中海貧血癥的癥狀有一定的耐受性，嚴(yán)重貧血的遺傳形式在地球上很多區(qū)域都非常常見，這項(xiàng)研究中研究者就發(fā)現(xiàn)了一種方法，可以利用CRISPR基因編輯技術(shù)來對(duì)患者產(chǎn)生類似的有益效應(yīng)。

此前研究者們知道，抑制或逆轉(zhuǎn)血紅蛋白亞單位的γ-β開關(guān)就可以提高成年人機(jī)體中胎兒血紅蛋白的水平，同時(shí)還會(huì)明顯改善β地中海貧血癥或鐮刀形細(xì)胞病患者的虛弱癥狀，研究者Weiss補(bǔ)充道，這項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)了一種基因組編輯介導(dǎo)療法的潛在DNA靶點(diǎn)，并且為治療β地中海貧血癥及鐮刀形細(xì)胞病提供了一種新方法。如今我們利用CRISPR基因編輯技術(shù)就可以靶向作用DNA，移除刺激γ-β開關(guān)的DNA片段，同時(shí)促進(jìn)成體紅細(xì)胞中胎兒血紅蛋白水平的持續(xù)性增長。

本文研究就揭示了除現(xiàn)有許多創(chuàng)新性策略的另外一種方法，同時(shí)研究者還比較了該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)所產(chǎn)生的胎兒血紅蛋白的水平。利用基因組編輯技術(shù)來恢復(fù)遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在癥或許是一種非常有吸引力的選擇；研究者強(qiáng)調(diào)說，目前利用這種新型基因編輯方法進(jìn)入臨床試驗(yàn)還維持過早，后期我們希望能夠繼續(xù)深入研究來改善基因編輯過程，并且再進(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)來將潛在有害的脫靶突變的可能性降到最低，此外對(duì)不同方法進(jìn)行對(duì)比來確定哪種方法最安全且最有效也是非常關(guān)鍵的，有待于我們后期進(jìn)一步研究分析。

利用改進(jìn)的CRISPR/Cas9技術(shù)直接改變細(xì)胞身份

在一項(xiàng)新的研究中，來自美國杜克大學(xué)的研究人員開發(fā)出一種不再需要導(dǎo)入額外基因拷貝的策略。相反，他們利用一種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9基因編程技術(shù)直接激活已經(jīng)存在于細(xì)胞基因組中的自然拷貝。

在這項(xiàng)新的研究中，Black、Gersbach和同事們利用經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)準(zhǔn)確地激活三種基因Brn2、Ascl1和Myt1l來自然地產(chǎn)生這些控制神經(jīng)元基因網(wǎng)絡(luò)的主轉(zhuǎn)錄因子，而不是導(dǎo)入攜帶這些額外基因拷貝的病毒。

研究人員先將細(xì)菌防御系統(tǒng)CRISPR/Cas9進(jìn)行基因修飾讓它與一種基因激活物偶聯(lián)在一起，這樣仍然能夠鑒定出特異性的DNA片段，但是不會(huì)切割靶片段，而是讓它們保持完整，同時(shí)利用基因激活物將靶片段激活。

在實(shí)驗(yàn)室中，將這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9系統(tǒng)注射到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中。檢測(cè)結(jié)果表明一旦被這種系統(tǒng)激活，這三種神經(jīng)元主轉(zhuǎn)錄因子基因就強(qiáng)力地激活神經(jīng)元基因。這導(dǎo)致這些成纖維細(xì)胞傳導(dǎo)電信號(hào)---神經(jīng)元的一種典型特征。而且即便將與CRISPR/Cas9偶聯(lián)的基因激活物取走后，這些細(xì)胞仍然保持它們的神經(jīng)元性質(zhì)。

這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用這種經(jīng)過基因修飾的CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生的神經(jīng)元在靶基因上的表觀遺傳程序與在小鼠大腦組織中自然發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元標(biāo)志相匹配。

根據(jù)Black的說法，接下來的行動(dòng)方案就是將這種方法拓展到人類細(xì)胞中，提高這種技術(shù)的效率，并且試圖清除其他的表觀遺傳障礙，這樣它可能能夠用來構(gòu)建特定疾病模型。

利用改進(jìn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效和特異性地實(shí)現(xiàn)單堿基突變

在一項(xiàng)新的研究中，利用一種引入DNA單個(gè)核苷酸變化的脫氨酶，來自日本神戶大學(xué)的研究人員構(gòu)建出一種改進(jìn)的CRISPR/Cas9工具，從而避免產(chǎn)生有害的雙鏈斷裂，使得利用CRISPR/Cas9技術(shù)引入的附帶突變最小化，而且也不需要加入DNA模板。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，人們通過將Cas9導(dǎo)入到細(xì)胞中對(duì)一種DNA序列進(jìn)行編輯而產(chǎn)生雙鏈斷裂，同時(shí)也將一種DNA模板導(dǎo)入到這種細(xì)胞中，這樣該細(xì)胞利用這種DNA模板修復(fù)這種斷裂。這種編輯過程依賴細(xì)胞的同源重組機(jī)制，然而其他的修復(fù)機(jī)制如NHEJ也來競(jìng)爭執(zhí)行這種修復(fù)任務(wù)，因而經(jīng)常導(dǎo)致不想要的和不準(zhǔn)確的序列插入和刪除。

為了構(gòu)建一種更加準(zhǔn)確的編輯工具，神戶大學(xué)科學(xué)家Akihiko Kondo和他的同事們將一種沒有核酸酶活性的不能夠切割雙鏈DNA的Cas9版本或一種產(chǎn)生單鏈切口的切口酶Cas9版本與一種來自七鰓鰻（sea lamprey）免疫系統(tǒng)的激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）融合在一起。在正常情形下，這種AID酶在免疫球蛋白和抗體基因中產(chǎn)生突變從而讓免疫系統(tǒng)具有多樣性。AID作用在單鏈DNA上，將胞嘧啶（C）替換為尿嘧啶（U），隨后在一輪DNA復(fù)制中，這種尿嘧啶（U）被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T）。

通過測(cè)試這種新的雜合復(fù)合物是否能夠在出芽酵母---缺乏一種內(nèi)源性的類似AID的系統(tǒng)---中修飾一種選擇性的標(biāo)志物，Kondo團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在向?qū)NA（gRNA）的引導(dǎo)下，這種蛋白復(fù)合物靶向作用于CAN1基因，而且相對(duì)于非靶向的選擇性標(biāo)志物，CAN1基因發(fā)生突變的頻率增加了1000倍。利用全基因組測(cè)序，研究人員發(fā)現(xiàn)很少的脫靶突變，只比背景突變率略有增加。論文第一作者、Kondo實(shí)驗(yàn)室博士后研究員Keiji Nishida說，“[在AID存在下]，這種脫靶突變率是可以接受的，相比于自然的背景突變率增加了不到10倍?！?/p>

研究人員也證實(shí)將兩種不同的gRNA與Cas9-AID復(fù)合物一起表達(dá)能夠同時(shí)對(duì)兩種基因進(jìn)行修飾。

相比于沒有核酸酶活性的Cas9-AID復(fù)合物，切口酶Cas9-AID復(fù)合物能夠在核苷酸替換位點(diǎn)的相反鏈上產(chǎn)生切口，基因編輯效率略高一些。Nishida解釋道，這是因?yàn)楹塑账崆谐迯?fù)（nucleotide excision repair, NER）能夠修復(fù)AID產(chǎn)生的核苷酸替換，“如果在互補(bǔ)鏈上產(chǎn)生一個(gè)切口，那么就不再有參照鏈來校正替換突變”，從而使得想要的核苷酸替換過程更有效率地進(jìn)行。

為了進(jìn)一步修飾，研究人員將尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil DNA glycosylase）抑制劑---與這種Cas9-AID復(fù)合物連接在一起，從而增加這種復(fù)合物產(chǎn)生C-T替換的效率，同時(shí)使得在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中發(fā)生的不想要的缺失突變最小化。

這種基因編輯復(fù)合物也能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表現(xiàn)良好，導(dǎo)致相對(duì)少的脫靶突變。在酵母細(xì)胞中，相對(duì)于表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，表達(dá)上述兩種改進(jìn)的DNA編輯復(fù)合物中的任何一種都能夠?qū)е滤鼈兏玫纳L，這提示著這種新的編輯工具也是毒性更小的。

CRISPR基因編輯技術(shù)又取得了哪些爆發(fā)式進(jìn)展

CRISPR基因編輯技術(shù)又取得了哪些爆發(fā)式進(jìn)展
CRISPR基因編輯技術(shù)正在大爆發(fā)，短短2個(gè)月內(nèi)，又取得了哪些進(jìn)展，引發(fā)了哪些爭端呢？本文由機(jī)器之心經(jīng)FLI（Future of Life Institute）獨(dú)家授權(quán)翻譯。FLI由MIT宇宙學(xué)家Max Tegmark和Skype聯(lián)合創(chuàng)始人Jaan Tallinn等人共同創(chuàng)立，顧問委員會(huì)包括企業(yè)家馬斯克和物理學(xué)家史蒂芬·霍金，致力于研究人工智能、基因編輯等前沿科技對(duì)人類未來生活的影響。

最新的基因編輯技術(shù)，可以做到什么地步？

成功讓雄性老鼠體細(xì)胞變成卵細(xì)胞
當(dāng)?shù)貢r(shí)間3月8日，在英國倫敦召開的第三屆人類基因組編輯國際峰會(huì)上，來自日本九州大學(xué)的林克彥（Katsuhiko Hayashi，音譯）教授介紹了該研究的詳細(xì)情況。
該技術(shù)包括首先從雄性老鼠身上提取皮膚細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)化成類似干細(xì)胞的狀態(tài)，以創(chuàng)建所謂的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS cells）——一種可以轉(zhuǎn)化為其他類型細(xì)胞的細(xì)胞。因?yàn)樵撈つw細(xì)胞從雄性老鼠身上提取，因此具有XY染色體。林克彥教授的團(tuán)隊(duì)剔除了其中的Y染色體，再向另一個(gè)細(xì)胞“借來”一個(gè)X染色體，然后將兩個(gè)X染色體巧妙地“粘”在一起。這一流程使得干細(xì)胞變成卵細(xì)胞。
“這其中最大的訣竅就是X染色體的復(fù)制?！绷挚藦┙淌谡f，“我們真的試圖建立一個(gè)系統(tǒng)來復(fù)制X染色體?！?br>最后，擁有兩個(gè)X染色體的這些細(xì)胞被放置在一個(gè)卵巢類器官中進(jìn)行培養(yǎng)，從而形成卵子。當(dāng)與正常精子受精后，科學(xué)家們獲得了大約600個(gè)胚胎，并將其植入代孕老鼠體內(nèi)。最終，代孕老鼠誕生了7只小鼠幼崽。
這些小老鼠看起來很健康，會(huì)有一個(gè)正常的壽命，并在成年后得以繼續(xù)生育后代。“它們看起來還不錯(cuò)，在正常生長，以后能夠成為父親?！绷挚藦┙淌诒硎?。實(shí)驗(yàn)中約1%的生產(chǎn)成功率低于用正常女性卵細(xì)胞能夠達(dá)到的5%的成功率。
不孕不育癥患者的新希望？
現(xiàn)階段該技術(shù)還不能安全用于人類
林克彥教授表示，該研究的主要?jiǎng)訖C(jī)是希望能夠?yàn)轭净疾辉胁挥Y的夫妻提供一種生育治療方法，例如患有特納綜合征的婦女，她們拷貝的X染色體有一整個(gè)或部分缺失的情況。
他繼續(xù)補(bǔ)充，目前，這項(xiàng)研究仍處于早期階段，卵細(xì)胞的質(zhì)量不高?！凹词乖诶鲜笊砩蠈?shí)驗(yàn)，卵細(xì)胞的質(zhì)量也存在很多問題。因此，在考慮將其作為一種生育治療方法之前，我們必須克服這些問題，這可能需要很長的時(shí)間?！彼硎尽?br>同時(shí)，在這個(gè)階段，技術(shù)還不能安全地用于人類。但是，他認(rèn)為這一問題能夠在10年內(nèi)得到解決。然而，部分科學(xué)家認(rèn)為這一時(shí)間估計(jì)過于樂觀，因?yàn)槟壳霸趯?shí)驗(yàn)室條件下還未能從女性細(xì)胞中創(chuàng)造出可行的人類卵細(xì)胞。并且，也有科學(xué)家提出，人類的細(xì)胞需要更長的培養(yǎng)時(shí)間來產(chǎn)生一個(gè)成熟的卵細(xì)胞，這可能會(huì)增加細(xì)胞獲得不必要的遺傳變化的風(fēng)險(xiǎn)。
此外，林克彥教授還提出對(duì)社會(huì)是否能夠接受這一技術(shù)的擔(dān)憂。他并不贊同男性用自己的精子和人工制造的卵細(xì)胞來創(chuàng)造一個(gè)嬰兒?！霸诩夹g(shù)上這是可能的。但是我不太確定在現(xiàn)在這個(gè)階段，它是否安全或?yàn)樯鐣?huì)所接受。”他補(bǔ)充到。林克彥教授已經(jīng)向科學(xué)雜志《自然》提交了這一研究。
中國科學(xué)院的王浩義教授認(rèn)為，在考慮將該技術(shù)應(yīng)用于臨床之前，還有很長的路要走。“科學(xué)家從不說永遠(yuǎn)，原則上，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)在老鼠身上完成了，當(dāng)然它可能在人類身上實(shí)現(xiàn)。但我可以預(yù)見到未來（該技術(shù)）會(huì)遇到很多挑戰(zhàn)，我無法預(yù)測(cè)（克服它們）將花費(fèi)多少年。”
紅星新聞?dòng)浾?王雅林 實(shí)習(xí)生 王慕寧

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