Science發(fā)表有里程碑意義的RNA測(cè)序研究(ChIP-seq綜述)

Science發(fā)表有里程碑意義的RNA測(cè)序研究

2016年08月25日訊 全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）鑒定了數(shù)百個(gè)心血管代謝疾?。–MD）的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。這些DNA位點(diǎn)大多位于非編碼區(qū)域，但人們對(duì)相應(yīng)的基因調(diào)控機(jī)制還知之甚少。西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的研究人員對(duì)六百名冠心病患者的不同組織進(jìn)行了基因分型和RNA測(cè)序。

“通過(guò)分析多個(gè)組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，我們鑒定了在單一組織起作用的致病基因，也發(fā)現(xiàn)了以網(wǎng)絡(luò)形式跨組織起作用的致病基因，”這篇文章的資深作者，西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的Johan Bj?rkegren教授說(shuō)。

這是首次對(duì)冠心?。–AD）患者血液、血管和代謝組織的RNA序列進(jìn)行系統(tǒng)性分析。這項(xiàng)具有里程碑意義的研究是STARNET項(xiàng)目的一部分，于八月十九日發(fā)表在Science雜志上。

“全基因組關(guān)聯(lián)研究鑒定了大量會(huì)提升CAD風(fēng)險(xiǎn)的DNA變異，”Dr. Bj?rkegren?！叭欢?，全基因組關(guān)聯(lián)研究只是了解CAD的第一步，要將風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為新的診療機(jī)遇，我們必須邁入下一個(gè)階段，找到受這些DNA變異影響而推動(dòng)疾病發(fā)展的基因。此外，我們也需要了解疾病基因在哪些組織、通路和分子網(wǎng)絡(luò)中起作用。像STARNET項(xiàng)目這樣鑒定疾病驅(qū)動(dòng)基因和相應(yīng)組織，是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化診療的前提?！?/p>

STARNET項(xiàng)目是Dr. Bj?rkegren和Arno Ruusalepp在2007年啟動(dòng)的。研究人員在冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)中收集了600名CAD患者的一些關(guān)鍵組織。他們發(fā)現(xiàn)，這些組織中的基因表達(dá)數(shù)據(jù)能夠提供寶貴的信息，不僅可以揭示CAD致病基因及其活性，對(duì)研究其他心血管代謝疾病和阿爾茨海默癥也很有幫助。

“我們驚訝的發(fā)現(xiàn)，除了肝臟以外，腹部脂肪對(duì)于調(diào)控血脂水平也很關(guān)鍵，”文章第一作者Oscar Franzén博士說(shuō)?！芭e例來(lái)說(shuō)，控制低密度脂蛋白（LDL）血液水平的PCSK9基因居然是在腹部脂肪中起作用的，而不是在調(diào)控血脂水平的主要場(chǎng)所--肝臟?！?最近，PCSK9作為降脂藥物的新靶標(biāo)受到了很大的關(guān)注。

STARNET這樣的基礎(chǔ)研究項(xiàng)目有助于探索CAD和其他復(fù)雜疾病的病因，“此前GWAS鑒定了不少DNA位點(diǎn)，我們明確了這些位點(diǎn)影響的基因。研究顯示，許多基因所在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及多種組織和疾病，”文章的另一位資深作者Eric Schadt教授說(shuō)?，F(xiàn)在研究人員正在與阿斯利康和SciLifeLab合作，嘗試開(kāi)發(fā)新的藥物靶標(biāo)。

冠心病是一種臨床上常見(jiàn)的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在冠心病中，由于冠狀動(dòng)脈病理性改變，脂肪沉著堆積在冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)并引起血流阻塞。這種疾病與血液中的脂肪含量有關(guān)，包括低密度脂蛋白（LDL膽固醇）、高密度脂蛋白（HDL膽固醇）和甘油三酯。近10年來(lái)，隨著生活水平的提高和平均壽命的延長(zhǎng)，我國(guó)冠心病發(fā)病率正在逐年上升，而且還有年輕化的趨勢(shì)。

Ottawa大學(xué)、Oxford大學(xué)和Broad研究所的科學(xué)家們?cè)谝豁?xiàng)大規(guī)模研究中解決了心血管領(lǐng)域的一個(gè)長(zhǎng)期爭(zhēng)議。研究人員通過(guò)千人基因組計(jì)劃（1000 Genomes project）的數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了將近一千萬(wàn)遺傳學(xué)變異（SNP）的信息，涉及全球48項(xiàng)研究的六萬(wàn)冠心病患者和十二萬(wàn)健康人。他們對(duì)冠心?。–AD）的遺傳學(xué)背景進(jìn)行了全面的考察。研究顯示，這種常見(jiàn)疾病的遺傳易感性主要取決于影響較小的普通SNP，而不是影響較大的罕見(jiàn)變異。

人們已經(jīng)了解了LDL在心臟病中的作用，并將其作為statin類藥物的作用靶標(biāo)。但HDL、甘油三酯和心臟病之間的關(guān)聯(lián)仍舊未能闡明。Broad研究所、麻省總醫(yī)院等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過(guò)大規(guī)模外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)，APOC3基因上的四個(gè)突變不僅能降低血液中的甘油三酯水平，還能顯著減少個(gè)體患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)（約40%）。這項(xiàng)研究發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)》雜志上，為人們提供了治療冠心病的新途徑。

頂級(jí)醫(yī)學(xué)期刊《柳葉刀》發(fā)表的一項(xiàng)大規(guī)模研究表明，工作時(shí)間長(zhǎng)會(huì)顯著提升中風(fēng)和冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)。加班加點(diǎn)地工作的確不利于健康，甚至?xí)＜澳愕纳?。倫敦大學(xué)學(xué)院的研究人員用25項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)分析了工作時(shí)間與冠心病之間的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)工作時(shí)間（每周工作35-40小時(shí)）相比，每周工作55小時(shí)以上會(huì)使冠心病風(fēng)險(xiǎn)提高13%。

ChIP-seq綜述

相比chip-chip，chip-seq提供了更高的分辨率，更少的noise以及更大的覆蓋度。隨著二代測(cè)序成本的快速下降，chip-seq將成為研究基因表達(dá)調(diào)控和表觀遺傳學(xué)必不可少的工具之一。

染色質(zhì)狀態(tài)的重要意義：染色質(zhì)的狀態(tài)一方面通過(guò)改變核小體的位置，DNA的包裝緊密程度直接影響著轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，另一方面獨(dú)特的組蛋白修飾將促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控元件的結(jié)合。系統(tǒng)性地研究不同細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)對(duì)于理解生命發(fā)育過(guò)程至關(guān)重要。

最早的chip-chip技術(shù)，是基于微陣列雜交原理的，旨在提供全基因組范圍的DNA-蛋白質(zhì)相互作用。在一個(gè)高密度的芯片上種有大量覆蓋基因組或指定區(qū)域的探針。

二代測(cè)序的發(fā)展在多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，包括全基因組測(cè)序、RNA-seq、結(jié)構(gòu)變異體的發(fā)現(xiàn)、DNase I超敏位點(diǎn)圖譜、從mRNA轉(zhuǎn)錄本中鑒定融合基因、新的小RNA的鑒定等。

ChIP-seq的應(yīng)用研究最早發(fā)表在2007年，感興趣的DNA片段被直接測(cè)序而不是雜交。研究中比較關(guān)鍵的一點(diǎn)是技術(shù)的分辨率相比chip-chip得到了提高，以至于能夠識(shí)別組蛋白變體比如H2A.Z。另外研究中還發(fā)現(xiàn)了一類二價(jià)染色質(zhì)狀態(tài)（bivalent domains），也就是同一染色質(zhì)區(qū)域同時(shí)具有激活和抑制性組蛋白標(biāo)記。這類標(biāo)記所標(biāo)記的基因可能預(yù)示著它們暫時(shí)處于沉默但隨時(shí)準(zhǔn)備開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄的“蓄勢(shì)”狀態(tài)，且這類基因很可能對(duì)于細(xì)胞譜系的發(fā)展、命運(yùn)決定起著關(guān)鍵性作用。

對(duì)于探究DNA結(jié)合蛋白，ChIP-seq的實(shí)驗(yàn)就是為了富集與特異蛋白結(jié)合的DNA。首先通過(guò)原位甲醛交聯(lián)DNA和蛋白，接著超聲打斷DNA成200-600bp的小片段，用抗體免疫沉淀感興趣的DNA-蛋白復(fù)合物。最后解交聯(lián)，對(duì)釋放的DNA進(jìn)行測(cè)序。

對(duì)于探究核小體位置或者組蛋白修飾，常常用到微球菌核酸酶（MNase)消化直接使染色質(zhì)片段化，不用甲醛交聯(lián)操作。實(shí)際上超聲也可以用來(lái)片段化，不過(guò)MNase更被廣泛應(yīng)用，因?yàn)樗梢愿鼜氐椎厝コ恍枰膌inker DNA使核小體mapping更精確。不過(guò)既然是酶切片段就不可避免地會(huì)有很多難以控制的因素，比如酶本身的序列結(jié)合偏好、酶切活性等。根據(jù)ChIP實(shí)驗(yàn)是否需要交聯(lián)分成X-ChIP和N-ChIP，X表示crosslinking，N表示native。

接下來(lái)的DNA建庫(kù)需要對(duì)片段化的DNA片段進(jìn)行大小篩選（一般是150–300bp范圍)。

Cost是很久以前的數(shù)據(jù)，現(xiàn)在的成本已大大降低。

首先chip-chip的應(yīng)用范圍就會(huì)受到限制，因?yàn)椴惶赡苊總€(gè)物種都專門(mén)制備高覆蓋度探針（覆蓋度本身就是問(wèn)題），探針數(shù)太多，生產(chǎn)耗時(shí)耗力，尤其是對(duì)于哺乳動(dòng)物基因組更是困難。

雜交過(guò)程本身就帶有很多bias，雜交效率難以準(zhǔn)確衡量，會(huì)受到GC含量、片段長(zhǎng)度、濃度、序列二級(jí)結(jié)構(gòu)等影響。且雜交測(cè)定的范圍也很大程度上受到限制。

ChIP-seq在解決chip-chip上述問(wèn)題的同時(shí)自身也有一些局限性：二代測(cè)序的準(zhǔn)確性在reads的尾端大幅度降低（不過(guò)可以通過(guò)優(yōu)良的生物信息學(xué)算法校正），片段富集以及測(cè)序過(guò)程都有GC傾向，正確地在測(cè)序儀上loading適量的DNA等（太少了信號(hào)弱，覆蓋度低；太多了熒光信號(hào)彼此干擾，數(shù)據(jù)質(zhì)量差）。

是ChIP成功與否的關(guān)鍵因素，也是產(chǎn)生較大batch effect的來(lái)源?？贵w的交叉反應(yīng)活性應(yīng)當(dāng)被嚴(yán)格地檢查，包括應(yīng)用RNAi實(shí)驗(yàn)敲低進(jìn)行特異組蛋白修飾的酶做驗(yàn)證、質(zhì)譜檢測(cè)沉淀下來(lái)的蛋白片段等。

典型的chip-seq實(shí)驗(yàn)要求10的7次方數(shù)量級(jí)的細(xì)胞，并產(chǎn)生10-100ng的DNA。有些chip-seq通過(guò)對(duì)protocol進(jìn)行優(yōu)化，降低到可以用10的4次方至10的5次方個(gè)細(xì)胞用來(lái)研究全基因組圖譜。因?yàn)榻◣?kù)需要PCR擴(kuò)增步驟，所以PCRbias是不可避免的（因此PCR循環(huán)數(shù)不能太高，盡可能低）。具體需要多少細(xì)胞和多少起始量DNA其實(shí)還要看研究的具體的TF或組蛋白修飾的豐度怎樣。

DNA片段化的bias: 非均勻的片段化、染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)更容易片段化造成。因此真正peaks calling需要對(duì)照，排除這類影響。

有三種常見(jiàn)的對(duì)照：

其中input DNA還是應(yīng)用最為廣泛的。

這個(gè)主要還是要根據(jù)樣本本身的特點(diǎn)來(lái)確定，還可以檢測(cè)一下saturation ponit

數(shù)據(jù)分析不是本文重點(diǎn)，簡(jiǎn)單提幾個(gè)點(diǎn)：

鑒定peaks時(shí)，正鏈、負(fù)鏈的reads需要向彼此進(jìn)行偏移，使得正負(fù)鏈的reads分布融合成一個(gè)中心區(qū)域的分布。（用的比較多的就是Poisson distribution)

有不同類型的peaks：sharp, broad and mixed，和檢測(cè)的TF、組蛋白修飾類型本身的分布特點(diǎn)有關(guān)。對(duì)于不同類型的peaks，peak calling的算法會(huì)有區(qū)別。

peak caller的performance可以通過(guò)qPCR、計(jì)算peaks和鄰近的motif之間的距離分布來(lái)簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)。

下游分析不可缺少的當(dāng)然是找motif，常用網(wǎng)站工具、軟件包括：

motif之間的相關(guān)性可以反映潛在的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

peaks注釋，相關(guān)性分析、聚類、GO分析也很常見(jiàn)。

ENCODE計(jì)劃、modENCODE、Roadmap等表觀遺傳學(xué)項(xiàng)目都致力于大范圍的基因組圖譜的建立以及不同測(cè)序數(shù)據(jù)的整合。

參考文獻(xiàn)：
ChIP–seq: advantages and challenges of a maturing technology
https://www.nature.com/articles/nrg2641

Nature子刊綜述幫你總結(jié)知識(shí)點(diǎn)：癌癥中的RNA，每個(gè)都是研究熱點(diǎn)

基因表達(dá)紊亂是癌癥的一個(gè)主要標(biāo)志。事實(shí)上，轉(zhuǎn)錄因子活動(dòng)的改變已被證明是一些癌癥最常見(jiàn)亞型的驅(qū)動(dòng)因素。RNA對(duì)基因表達(dá)至關(guān)重要，無(wú)論是以蛋白編碼RNA（mRNAs）的形式，還是以參與和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA形式（lncRNAs或snRNA）、剪接（snRNAs）和翻譯（核糖體RNAs、tRNAs和microRNAs）。 最近的證據(jù)表明，RNA的加工在癌癥中被系統(tǒng)改變，證明RNA對(duì)腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和進(jìn)展的重要影響。

2020年10月，來(lái)自澳大利亞的研究人員在《 Nature Reviews Cancer 》發(fā)表題為“RNA in cancer”的綜述， 討論了編碼和非編碼RNA的加工或活性改變?nèi)绾未龠M(jìn)腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)和進(jìn)展，強(qiáng)調(diào)了RNA在癌癥中的既定角色（miRNA和lncRNA）和新興角色（選擇性mRNA加工和circRNA）以及它們對(duì)癌癥的作用機(jī)制。

一旦RNA聚合酶II合成了 mRNA ，它必須首先剪接并進(jìn)一步加工成成熟的轉(zhuǎn)錄物，然后從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。這些相互連接的處理步驟是由許多大分子復(fù)合物完成的，例如剪接體和轉(zhuǎn)錄-輸出復(fù)合物TREX和TREX2。

在生理?xiàng)l件下，基因表達(dá)也可以通過(guò)一些 非編碼RNA ，包括miRNAs、lncRNAs和circRNAs來(lái)調(diào)節(jié)。通常，miRNAs通過(guò)加速靶基因的去乙?；徒到鈦?lái)負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，而lncRNAs則通過(guò)作為調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物的支架、定位到基因組DNA或改變基因組結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)順式或反式的基因表達(dá)。

許多miRNAs被發(fā)現(xiàn)與癌癥相關(guān)，要么作為腫瘤抑制因子，要么作為癌基因。

miRNA的作用： 人類細(xì)胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平受到一個(gè)或多個(gè)miRNA的某種程度的調(diào)控。單個(gè)miRNA可以具有許多mRNA靶標(biāo)，而單個(gè)mRNA可以被多個(gè)miRNA靶向。盡管miRNA可以共同作用，以抑制在3'非翻譯區(qū)（UTR）中具有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)的靶標(biāo)的表達(dá)，僅一種類型的miRNA與靶標(biāo)mRNA的結(jié)合導(dǎo)致相對(duì)溫和減少靶基因表達(dá)。通過(guò)RNA測(cè)序已經(jīng)檢測(cè)到1000多種不同的miRNA。一些miRNAs，如腫瘤抑制因子let-7，在幾乎每種細(xì)胞類型中都有大量表達(dá)，而另一些miRNAs具有高度的細(xì)胞類型特異性表達(dá)，或者在某些細(xì)胞類型中以非常低的水平存在或不存在。因此在檢測(cè)低表達(dá)的miRNAs的可能影響時(shí)，需要謹(jǐn)慎。

致癌和抑癌的miRNA：

1. 靶向致癌途徑負(fù)調(diào)控因子的miRNAs在失調(diào)時(shí)可能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)抑制RAS-MEK-ERK信號(hào)和miR-155/miR-221，它們分別針對(duì)SHIP1（也稱為INPP5D）和PTEN，這兩個(gè)都是AKT信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)器。

2. 在癌癥中最常見(jiàn)減少的miRNA是let-7 miRNA突變體，它通過(guò)靶向強(qiáng)效癌基因，包括MYC、KRAS和HMGA2作為主要的腫瘤抑制因子。因此，let-7 miRNAs被認(rèn)為是一個(gè)重要的治療靶標(biāo)。

3. 大量miRNAs也被報(bào)道通過(guò)限制或逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來(lái)限制轉(zhuǎn)移和/或化療耐藥，其中最有效的是miR-200家族。

miRNA失調(diào)的機(jī)制： miRNA基因由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，因此受到與蛋白質(zhì)編碼基因相同類型的表觀遺傳調(diào)控。事實(shí)上，許多miRNA基因都來(lái)自于蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子。在癌癥中有許多關(guān)于miRNAs表觀遺傳失調(diào)的報(bào)道。 癌癥中miRNA表達(dá)水平廣泛下調(diào)的一種模式是源于缺氧誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中Drosha和Dicer表達(dá)水平的降低 ，以及AGO2的磷酸化 ，進(jìn)而降低了Dicer與AGO2并抑制miRNA從前體到成熟miRNA的加工。 然而，并不是所有的miRNAs都會(huì)受到缺氧的下調(diào)， 例如，miR-210的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)可以覆蓋缺氧誘導(dǎo)的加工減少，并且可以抑制免疫缺陷小鼠腫瘤生長(zhǎng)的啟動(dòng)，但也可以促進(jìn)細(xì)胞在腫瘤缺氧的應(yīng)激環(huán)境中的適應(yīng)和生存。 miRNAs下調(diào)的另一個(gè)機(jī)制可能是由于基因突變或前miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin 5（XPO5）磷酸化水平的變化而減少核的輸出。

lncRNAs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有致癌或腫瘤抑制功能。

lncRNAs的作用： lncRNAs是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸不編碼蛋白質(zhì)的RNA。與mRNAs一樣，它們由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄，但與mRNAs不同， 許多l(xiāng)ncRNAs優(yōu)先定位于細(xì)胞核。它們具有不同的功能，包括核作用，如調(diào)節(jié)順式或反式中的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)剪接以及亞單位透明結(jié)構(gòu)域的成核。2010年，lncRNA HOTAIR通過(guò)參與染色質(zhì)重塑促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移，隨后發(fā)現(xiàn)許多l(xiāng)ncRNA具有影響癌癥發(fā)展或進(jìn)展的功能。一些lncRNAs可能具有多種看似不相關(guān)的功能。 例如，lincRNA-p21最初被鑒定為p53誘導(dǎo)的腫瘤抑制因子lncRNA80，并被證明介導(dǎo)異質(zhì)性核糖核蛋白K（HNRNPK）與其鄰近基因CDKN1A（編碼p21）的結(jié)合并增加其轉(zhuǎn)錄。

致癌和抑癌的lncRNA：

1. 最近的一項(xiàng)研究揭示了lncRNA-REG1CP在結(jié)直腸癌中的表達(dá)經(jīng)常上調(diào)。REG1CP通過(guò)將解旋酶FANJ與相鄰基因REG3A86的啟動(dòng)子連接，促進(jìn)結(jié)直腸癌異種移植瘤的生長(zhǎng)。

2. PCAT19是一種致癌的lncRNA，它激活反式基因，促進(jìn)前列腺癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。

3. 細(xì)胞質(zhì)lncRNAs也可能是癌基因。在MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤中過(guò)度表達(dá)的lncRNA linc0255，通過(guò)與核糖體蛋白R(shí)PL35的相互作用特別激活E2F1的翻譯。

4. lncRNAs也可以作為腫瘤抑制劑。核lncRNA DIRC3影響局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，激活編碼腫瘤抑制因子IGFBP5的鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。

5. lncRNAs也可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中的信號(hào)來(lái)抑制腫瘤。細(xì)胞質(zhì)lncRNA-DRAIC在去勢(shì)抵抗的晚期前列腺癌中下調(diào)，并通過(guò)干擾NF-κB激酶（IKK）活性抑制劑抑制核因子-κB（NF-κB）激活來(lái)抑制其進(jìn)展。

6. 一些lncRNAs仍然有可能編碼小蛋白。事實(shí)上，lncRNA LINC00908可以產(chǎn)生一種60個(gè)氨基酸的多肽，與正常組織樣本相比，該多肽在三陰性乳腺癌組織中下調(diào)，并且與整體生存率差有關(guān)。

lncRNAs的多重對(duì)立效應(yīng)： 關(guān)于lncRNA基因在癌癥中的影響，最能說(shuō)明問(wèn)題的一個(gè)例子是考慮lncRNA基因在強(qiáng)效癌基因表達(dá)中的作用，也可能反映了MYC在驅(qū)動(dòng)對(duì)增殖和生長(zhǎng)信號(hào)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中所起的關(guān)鍵作用，MYC基因的轉(zhuǎn)錄受多個(gè)鄰近lncRNA基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。這也凸顯了lncRNA基因座可以產(chǎn)生具有不同甚至相反功能的RNA。通過(guò)對(duì)小鼠體內(nèi)大量MALAT1 lncRNA進(jìn)行基因缺失研究的對(duì)比解釋，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了lncRNA對(duì)基因表達(dá)影響的復(fù)雜性。

circRNA的新角色： circRNAs基本上在所有細(xì)胞和組織中都有表達(dá)，并且在癌癥中可能被錯(cuò)誤調(diào)節(jié)。circRNA主要是反向剪接事件的產(chǎn)物，它將外顯子拼接到前一個(gè)外顯子而不是下游外顯子上，從而形成共價(jià)閉合的circRNA分子。有報(bào)道稱， 一些circRNA位于細(xì)胞核內(nèi)并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，但大多數(shù)circRNAs位于細(xì)胞質(zhì)中。 單個(gè)細(xì)胞可以表達(dá)數(shù)千個(gè)circRNAs，通過(guò)對(duì)患者腫瘤和癌細(xì)胞系RNA的深度測(cè)序，總共檢測(cè)到超過(guò)200000個(gè)不同的circRNAs。 一些circRNAs被發(fā)現(xiàn)在癌癥中與相應(yīng)的正常組織相比過(guò)度表達(dá)，增加了它們作為疾病生物標(biāo)志物的可能性。 circRNAs有可能作為癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用， 可能是通過(guò)充當(dāng)miRNAs的海綿，而一項(xiàng)敲除篩選表明，前列腺癌細(xì)胞中一些高度豐富的circRNAs對(duì)細(xì)胞的最大增殖至關(guān)重要，雖然還需要更多的工作來(lái)確定致癌或腫瘤抑制circRNAs。 circRNA可能還充當(dāng)多蛋白復(fù)合物的核因子或組分。

失調(diào)的circRNAs： 什么導(dǎo)致癌癥中的細(xì)胞周期失調(diào)？基因拷貝數(shù)或circRNA前體轉(zhuǎn)錄的改變無(wú)疑改變了它們?cè)谀承┌┌Y中的水平。然而，由于大多數(shù)circRNAs是來(lái)自蛋白質(zhì)編碼基因的選擇性剪接產(chǎn)物，因此需要仔細(xì)區(qū)分這些變化的影響與同源蛋白水平變化的影響。circRNA水平變化的另一種方式是通過(guò)參與circRNA生物合成的剪接因子水平的改變。

mRNA前體的剪接以去除內(nèi)含子并以不同的方式連接外顯子是基因表達(dá)的基礎(chǔ)。事實(shí)上，選擇性剪接可以通過(guò)產(chǎn)生選擇性蛋白質(zhì)亞型來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的多樣性。這個(gè)過(guò)程是由主要的剪接體完成的，它執(zhí)行大多數(shù)的RNA剪接反應(yīng)，并且與300多種不同的蛋白質(zhì)相關(guān)。

一旦mRNAs被剪接和多聚腺苷酸化，它們必須從細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄和加工部位輸出到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯。有效的mRNA輸出是通過(guò)將基因表達(dá)途徑中的上游過(guò)程（即轉(zhuǎn)錄、剪接和多聚腺苷酸化）與mRNA輸出耦合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。mRNA不斷地通過(guò)核孔復(fù)合體的內(nèi)部通道運(yùn)輸，使蛋白質(zhì)和分子能夠穿過(guò)核膜。 轉(zhuǎn)錄、RNA剪接和多聚腺苷酸化與mRNA輸出之間存在廣泛的耦合，對(duì)腫瘤的發(fā)生具有重要意義。

mRNA剪接的新角色： mRNA剪接在歷史上被認(rèn)為是一個(gè)內(nèi)控過(guò)程，對(duì)多外顯子基因的表達(dá)至關(guān)重要，但最近的研究結(jié)果顯示了RNA剪接機(jī)制的調(diào)控潛力。改變的mRNA剪接機(jī)制如何促進(jìn)腫瘤的發(fā)生？SRSF2、SF3B1和U2AF1的突變都不同程度地影響3′剪接位點(diǎn)識(shí)別。這種改變的剪接可能會(huì)影響編碼促進(jìn)轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。

選擇性裂解和聚腺苷酸化： 在腫瘤中也廣泛觀察到下游mRNA處理步驟的改變，如前體mRNAs的裂解和多聚腺苷酸化。例如，3′UTR區(qū)在腫瘤細(xì)胞系和腫瘤標(biāo)本中均發(fā)生縮短。

選擇性mRNA輸出的新興作用： 基因表達(dá)途徑的末端步驟之一，mRNA的核輸出，在癌癥中也發(fā)生了改變。雖然mRNA輸出被認(rèn)為是基因表達(dá)中的一個(gè)普遍的、默認(rèn)的途徑，但是特定的生物途徑可以通過(guò)選擇性的mRNA輸出來(lái)調(diào)節(jié)，使某些mRNAs優(yōu)先于其他的。選擇性mRNA輸出可以調(diào)節(jié)對(duì)癌癥發(fā)展至關(guān)重要的生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖和基因組完整性。這種mRNA輸出機(jī)制的調(diào)節(jié)潛力可被癌細(xì)胞利用以維持增殖。

在過(guò)去的幾年里，大量的研究已經(jīng)非常詳細(xì)地揭示了RNA在癌癥中發(fā)生系統(tǒng)性改變的程度。癌癥中編碼和非編碼RNA的廣泛改變影響了腫瘤發(fā)生的多個(gè)方面。

這些不同的RNA亞型和處理它們的蛋白質(zhì)參與癌癥發(fā)生的機(jī)制特性，為治療干預(yù)提供機(jī)會(huì)。例如，一些以核心剪接體機(jī)制為靶點(diǎn)的化合物，如與SF3B復(fù)合物結(jié)合的E7107，在體內(nèi)影響RNA剪接，但在I期臨床試驗(yàn)中靜脈注射時(shí)表現(xiàn)出顯著的毒性。最近的研究表明，在具有剪接體突變的晚期血液惡性腫瘤中，使用SF3B復(fù)合物H3B-8800的可口服調(diào)節(jié)劑，在耐受劑量良好的小鼠模型中顯示了優(yōu)先抗腫瘤活性。其他研究試圖通過(guò)使用介導(dǎo)其蛋白酶體降解的化合物作為干擾剪接的替代藥理學(xué)手段來(lái)調(diào)節(jié)選擇性和調(diào)節(jié)性剪接因子，如RBM39，在小鼠急性髓系白血病模型中獲得成功。RNA在癌癥中的廣泛改變將為治療提供大量的新機(jī)會(huì)。進(jìn)一步闡明RNA加工改變促進(jìn)腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和進(jìn)展的基本機(jī)制，對(duì)于確保癌癥療法專門(mén)針對(duì)RNA加工過(guò)程且對(duì)正常細(xì)胞的影響最小至關(guān)重要。

首發(fā)公號(hào)：國(guó)家基因庫(kù)大數(shù)據(jù)平臺(tái)

參考文獻(xiàn)

Goodall, G.J., Wickramasinghe, V.O. RNA in cancer.?Nat Rev Cancer?(2020). https://doi.org/10.1038/s41568-020-00306-0.

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