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本報(bào)重慶訊 重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院和重慶大學(xué)生物工程學(xué)院共同開(kāi)展的重慶市科委自然科學(xué)基金項(xiàng)目“藥用紫錐菊(Echiancea purpurea)葉片離體培養(yǎng)技術(shù)”研究為實(shí)現(xiàn)藥用紫錐菊種苗工廠化快速繁殖提供了新途徑?？蒲腥藛T以藥用紫錐菊葉片為外植體，利用組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)愈傷組織，成功地使其再分化形成完整植株。該研究建立的紫錐菊離體葉片的最佳培養(yǎng)條件可實(shí)現(xiàn)種苗快速生根，且生根率很高。此前利用藥用紫錐菊葉片進(jìn)行組培技術(shù)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
紫錐菊為多年生草本植物，其含有羥基酰胺、多糖、倍半萜、多炔類(lèi)、咖啡酸衍生物、黃酮等多種活性成分。藥理研究顯示，原產(chǎn)于美洲的藥用紫錐菊對(duì)免疫功能有促進(jìn)作用，可用于感染、感冒、關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、氣管炎、扁桃體炎、濕疹等的治療。近年來(lái)，該植物受到國(guó)際上的普遍重視，成為國(guó)際市場(chǎng)需求量最大的植物藥之一。我國(guó)北京、沈陽(yáng)、山東等地近兩年從歐洲和美洲成功引種該植物。但是，由于傳統(tǒng)的種子育苗繁殖方法存在種子采集困難、發(fā)芽率低、需要低溫春化處理工藝等問(wèn)題，生產(chǎn)有較大難度，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?，不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。因此，進(jìn)行藥用紫錐菊的組培快繁再生技術(shù)研究非常必要。
在研究中，科研人員在藥用紫錐菊的種苗上采取較嫩的葉片，對(duì)其進(jìn)行消毒處理后，將其接種到附加不同生長(zhǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其生長(zhǎng)。研究中選用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+吲哚-3-丁酸（0.5~3.0毫克/升）+萘乙酸（0.5~2.0毫克/升）+蔗糖（30克/升）+瓊脂（7克/升）。增殖培養(yǎng)基為MS+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+6-芐基腺嘌呤（0.3~0.9毫克/升）+赤霉素(0.1~0.7毫克/升)+蔗糖（30克/升）+瓊脂（7克/升）。生根培養(yǎng)基為1/2MS+吲哚-3-丁酸(0.5毫克/升)+萘乙酸(0.1毫克/升)+蔗糖（30克/升）+瓊脂（7克/升）。培養(yǎng)溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度2500勒克斯左右，光照時(shí)間12~14小時(shí)/天。
在接種8天后，葉片切口周?chē)霈F(xiàn)膨大致密的翠綠色愈傷組織。兩周后，愈傷組織不斷增殖，逐漸形成圓形顆粒狀突起。3周后，圓形突起形成綠色不定芽，繼而伸長(zhǎng)形成小芽苗。平均每塊外植體可誘導(dǎo)5～11芽苗，且都在切塊的邊緣排列。培養(yǎng)25天后可形成具有肥綠葉片的小芽苗。
研究表明，不同激素濃度對(duì)植物愈傷組織的誘導(dǎo)分化和植株再生有重要影響。研究人員通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中施加不同濃度的萘乙酸和吲哚-3-丁酸檢驗(yàn)對(duì)葉片愈傷組織的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥用紫錐菊的葉片適宜在MS+吲哚-3-丁酸(2毫克/升)+萘乙酸(1毫克/升)+蔗糖(30克/升)+瓊脂(7克/升)培養(yǎng)基上分化成苗。
在增殖培養(yǎng)中，待芽伸長(zhǎng)并長(zhǎng)出綠色葉片時(shí)，科研人員將苗分割成單株，將其轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上。20～25天后，小芽基部膨大，或增殖形成具有3～4個(gè)小芽的叢生芽，芽苗可長(zhǎng)成3～5厘米的無(wú)根苗。一般30～35天繼代培養(yǎng)1次。在繼代培養(yǎng)中，需將大芽叢分割成小芽叢，剪去過(guò)長(zhǎng)的葉片，或?qū)⑵浣臃N在新的增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，并適當(dāng)增強(qiáng)光照強(qiáng)度，使苗生長(zhǎng)健壯。不同的激素配比對(duì)叢生芽的出芽率有明顯的影響。要保持芽苗長(zhǎng)勢(shì)良好，且分化出芽時(shí)不長(zhǎng)愈傷組織，培養(yǎng)基應(yīng)為MS+6-芐基腺嘌呤(0.7毫克/升)+赤霉素(0.5毫克/升)+吲哚-3-丁酸(0.2毫克/升)+蔗糖(30克/升)+瓊脂(7克/升)。
據(jù)介紹，紫錐菊的試管苗生根較為容易，即將高3厘米以上的無(wú)根苗切下，將其轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)。12天時(shí)開(kāi)始發(fā)根，25天后全部生根率達(dá)99％。根的數(shù)量為8～12條，最長(zhǎng)約3厘米，平均長(zhǎng)1.2厘米。激素對(duì)紫錐菊生根也有一定影響。當(dāng)培養(yǎng)基為1/2MS+萘乙酸（0.1毫克/升）+吲哚-3-丁酸（0.5毫克/升）+蔗糖(30克/升)+瓊脂(7克/升)時(shí)，生根效果好，根系較發(fā)達(dá)。培養(yǎng)4周后，根數(shù)達(dá)8~12條，根長(zhǎng)達(dá)3厘米左右。此時(shí)即可移栽。移栽前必須煉苗5~7天，即將苗取出，洗去附著在苗上的培養(yǎng)基，將其移栽到泥炭土及腐質(zhì)土混合的基質(zhì)中，并注意保溫、保濕。該方法的成活率可達(dá)90％。試管苗移栽3～4周后就可長(zhǎng)出新根、新葉。成活后，可按常規(guī)進(jìn)行栽培管理。
另外，研究人員還對(duì)葉片和葉柄不同部位的誘導(dǎo)分化和增殖能力進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉片和葉柄越幼嫩，分化增殖能力越強(qiáng)；葉柄的分化主要出現(xiàn)在基部，數(shù)目較少，成苗速度快，芽苗健壯；葉片分化一般取中下部為宜，所誘導(dǎo)的不定芽數(shù)目多，成苗較慢，芽苗較弱。
（李標(biāo) 唐坤 王伯初）
藥用植物以其獨(dú)特的療效、較小的毒副作用等特點(diǎn)，引起世界各國(guó)的普遍關(guān)注，其需求量日漸增多。中藥有效成分是其具有確切臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。藥效物質(zhì)的有無(wú)（真?zhèn)危?、多寡（?yōu)劣）是其品質(zhì)的核心部分。但是由于植物藥成分復(fù)雜、藥效物質(zhì)不明確、來(lái)源不一，且不同制劑工藝各異，造成質(zhì)量難以控制，加之植物藥材的造假問(wèn)題也很突出，這些都阻礙了藥用植物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)由于自然環(huán)境的破壞以及人們長(zhǎng)期的過(guò)度采挖和濫用，使很多的原料性藥用植物資源已面臨枯竭的威脅，野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。
因此，應(yīng)對(duì)保障與提升重要藥用植物品質(zhì)的國(guó)家需求，以及中藥野生資源短缺、品質(zhì)嚴(yán)重退化的嚴(yán)峻形勢(shì)，就需要更好地開(kāi)發(fā)利用藥用植物資源，改良和提升其品質(zhì)，加大工業(yè)化生產(chǎn)力度，提高藥效物質(zhì)產(chǎn)量以滿足市場(chǎng)需求，同時(shí)加大對(duì)野生資源的保護(hù)力度，使其更好地、可持續(xù)地為人類(lèi)所用。
藥用植物開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中存在種類(lèi)和數(shù)量不清、種質(zhì)資源保存困難、野生資源遭受?chē)?yán)重破壞、人工栽培品種品質(zhì)退化等諸多問(wèn)題，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。如何有效對(duì)藥用植物資源進(jìn)行分類(lèi)鑒定，保護(hù)瀕危和緊缺資源修復(fù)和再生，防止退化和滅絕，以實(shí)現(xiàn)保障藥材可持續(xù)供應(yīng)，提升藥材質(zhì)量，是現(xiàn)代藥用植物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域最亟需解決的課題，也是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化、國(guó)際化的關(guān)鍵措施。
藥用植物傳統(tǒng)分類(lèi)和鑒別方法主要依據(jù)藥材顏色、形狀、氣味、味道和質(zhì)地等感觀特征，其不足之處在于對(duì)這些特征的把握因人而異，具有很強(qiáng)的主觀性，且強(qiáng)調(diào)經(jīng)驗(yàn)積累，準(zhǔn)確性不強(qiáng)，得不到國(guó)際同行的廣泛認(rèn)可。因此如何從分子水平揭示種質(zhì)間差異成為研究者十分關(guān)心的問(wèn)題。現(xiàn)代生物技術(shù)為藥用植物種質(zhì)鑒定開(kāi)辟了一條新道路。
DNA分子標(biāo)記（DNA molecular markers）是以脫氧核糖核酸分子差異為基礎(chǔ)的一種標(biāo)記，一般具有快速、微量、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、結(jié)果直觀可靠且不受生育階段、供試部位、環(huán)境條件、貯藏等因素的影響等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。
DNA分子標(biāo)記在藥用植物研究中的應(yīng)用最先開(kāi)始于日本。應(yīng)用最早且最多的是藥材的真?zhèn)舞b定及品種分類(lèi)。較早的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（restriction fragment length polymorphism，RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，更加高效、快捷的DNA分子標(biāo)記如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（sequence charactered amplified region，SCAR）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列間長(zhǎng)度多態(tài)性（inter-simple sequence repeat，ISSR）、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，SSCP）等相繼出現(xiàn)，并且被應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源研究中的各個(gè)方面。
臺(tái)灣中興大學(xué)應(yīng)用RFLP技術(shù)精確鑒定出了苦參與其偽品[2]，紀(jì)寶玉等[3]對(duì)野葛的研究表明，RAPD可作為種質(zhì)資源篩選鑒定的關(guān)鍵技術(shù)；郝崗平等[4]將AFLP技術(shù)成功應(yīng)用于丹參的道地性鑒別；潘清平等[5]采用ISSR技術(shù)為玉竹商品藥材的鑒定提供了分子依據(jù)等。由此可見(jiàn)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)是一種有效鑒定藥用植物的方法。
表 1對(duì)幾種常用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了比較，每種方法各有優(yōu)點(diǎn)及局限性，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、材料和?shí)驗(yàn)條件綜合考慮進(jìn)行選擇。
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DNA條形碼（DNA barcoding）是以一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)DNA序列作為標(biāo)記來(lái)實(shí)現(xiàn)物種鑒定，類(lèi)似于超市利用條形碼掃描區(qū)分不同的商品，具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。
Chen等[6]對(duì)藥用植物及近緣種的4 800個(gè)物種6 600個(gè)樣本進(jìn)行研究，證明ITS2在藥用植物鑒定中能發(fā)揮關(guān)鍵作用；劉美子等[7]發(fā)現(xiàn)ITS2序列對(duì)9種采自不同地域的常見(jiàn)蒿屬物種水平鑒定成功率最高，可以作為鑒定蒿屬植物的潛在條形碼；崔志偉等[8]利用ITS2和psbA-tmH有效區(qū)分不同品種金銀花，說(shuō)明ITS2和psbA-tmH可以作為鑒定金銀花不同品種的優(yōu)勢(shì)條形碼組合；李櫟等[9]對(duì)茜草科黎藥植物的鑒定研究表明，ITS2序列可以對(duì)海南茜草科黎藥植物進(jìn)行快速鑒定。
近些年來(lái)，新發(fā)展起來(lái)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記技術(shù)可對(duì)不同等位基因之間僅有的個(gè)別堿基差異或只有小的插入、缺失等核苷酸差異進(jìn)行檢測(cè)，用以區(qū)分2個(gè)個(gè)體遺傳物質(zhì)的差異[10]。Chen等[11]采用SNP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合ITS2、matK和psbA-trnH標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列，成功鑒定出了高麗參和西洋參。證明基于DNA條形碼的SNP標(biāo)記技術(shù)可以作為識(shí)別人參屬的有效手段。SNP可直接以序列變異作為標(biāo)記，其檢測(cè)分析方法用高精尖的DNA芯片技術(shù)代替了傳統(tǒng)的凝膠電泳，被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記。
DNA條形碼技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)物種的快速有效鑒定，已成為現(xiàn)今藥用植物種質(zhì)資源分類(lèi)與鑒定的主流方法。
傳統(tǒng)藥用植物種質(zhì)資源保存一般采用種子庫(kù)的方法，存在占用空間大、保存物種數(shù)量有限、管理麻煩、容易染菌發(fā)霉及保存時(shí)間短等不足。利用生物技術(shù)方法進(jìn)行離體保存，可以很好解決上述問(wèn)題。保存材料經(jīng)復(fù)蘇后，可短時(shí)間快速繁殖大量種苗，不受自然環(huán)境影響，省時(shí)省力，同時(shí)降低劣變發(fā)生頻率，達(dá)到隨時(shí)使用和長(zhǎng)期保存優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的目的[12]。
依靠植物細(xì)胞全能性，將外植體接種在MS半固體培養(yǎng)基上或液體培養(yǎng)基的濾紙上，然后放在常溫或低溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并適時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)[13]，組織培養(yǎng)保存法分常溫繼代保存法和緩慢生長(zhǎng)保存法。組織培養(yǎng)保存法能有效擴(kuò)大繁殖藥用植物，緩解野生資源不能滿足市場(chǎng)需求的境況，同時(shí)也是保護(hù)瀕危珍稀藥用植物的有效手段。
（1）常溫繼代保存法：在常溫條件下，每隔一段時(shí)間，將外植體進(jìn)行新一輪的繼代培養(yǎng)，以達(dá)到保存種質(zhì)的目的，需要時(shí)還可以隨時(shí)進(jìn)行擴(kuò)繁[14]。對(duì)鐵皮石斛種質(zhì)資源采用該方法保存取得了一定效果，并成功建立鐵皮石斛快速繁殖體系[13]。該方法間隔時(shí)間短，需要不斷繼代培養(yǎng)。
（2）緩慢生長(zhǎng)保存法：通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，在保證不使外植體死亡的情況下抑制其生長(zhǎng)，盡量減少營(yíng)養(yǎng)物的消耗，從而盡可能延長(zhǎng)繼代培養(yǎng)時(shí)間。主要措施有降低溫度、調(diào)整滲透壓、控制養(yǎng)分水平、使用生長(zhǎng)抑制劑或延緩劑、控制培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)配比以及調(diào)節(jié)光照等[13]。對(duì)山銀花進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，探索出了最適于山銀花種質(zhì)離體保存的條件[15]。
該法不需要繼代即可長(zhǎng)期保存植物種質(zhì)，因此引起遺傳變異相對(duì)小。目前最成熟的超低溫保存法是玻璃化法。利用高濃度復(fù)合保護(hù)劑處理植物培養(yǎng)物一定時(shí)間后用液氮速凍，使植物細(xì)胞內(nèi)外溶液固化成無(wú)定形的玻璃化狀態(tài)，避免了冰晶在形成和融化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械破壞作用。此狀態(tài)下植物細(xì)胞內(nèi)新陳代謝、生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，同時(shí)又保持了生物材料的形態(tài)發(fā)生潛能[16]，是一種保存種質(zhì)的有效方法。
對(duì)西洋參懸浮細(xì)胞的超低溫保存的探索性研究證明了該方法的可行性[17]；包埋玻璃化法超低溫保存技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)山藥種質(zhì)離體保存[18]；采用玻璃化法保存瀕危植物矢車(chē)菊，成功實(shí)現(xiàn)了其莖尖的凍存程序[19]。
在滴凍法和玻璃化法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的小滴玻璃化法具有高存活率、高再生率、廣適性、處理量大、操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)[20]。小滴玻璃化法在藥用植物種質(zhì)保存應(yīng)用方面的報(bào)道還較少，但在其他植物上的應(yīng)用可以作為借鑒。
人工種子是用能提供養(yǎng)分的膠囊包裹組織培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體，再在膠囊外包上一層保護(hù)膜，形成一種類(lèi)似于天然種子的結(jié)構(gòu)。人工種子有不受季節(jié)限制、更好的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和抗病能力、能保持優(yōu)良品種的遺傳特性、方便貯藏運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。在瀕危藥用植物種質(zhì)資源保存上大有用武之地。
長(zhǎng)期以來(lái)，許多名貴珍稀的藥用植物由于其獨(dú)特的治病、保健、美容功效而供不應(yīng)求，原藥材價(jià)格持續(xù)走高，極大刺激了人們對(duì)野生珍稀藥用植物資源的掠奪性采挖和收購(gòu)，造成資源的毀滅性破壞。另外，全球氣候變暖等自然環(huán)境的變化也使得很多地區(qū)不再適合原有藥用植物的生長(zhǎng)。多方面原因綜合導(dǎo)致多種珍稀藥用植物資源瀕臨滅絕。
人工種子技術(shù)對(duì)于瀕危植物種質(zhì)資源保存具有重大意義。但該技術(shù)依賴(lài)于植物組織培養(yǎng)，對(duì)于難以進(jìn)行組培的植物則不適用。
運(yùn)用器官培養(yǎng)、植物干細(xì)胞培養(yǎng)等[30]生物技術(shù)方法也能很好地實(shí)現(xiàn)藥用植物資源的可持續(xù)利用。此外，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源的鑒定、保護(hù)對(duì)象和原地保護(hù)單元的確定、遷地保護(hù)的取樣策略和效果評(píng)價(jià)、瀕危原因的科學(xué)闡明等方面的應(yīng)用，也可以為珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)策略制定及措施實(shí)施提供參考。
生物技術(shù)的運(yùn)用既能使藥用植物資源得到更好地開(kāi)發(fā)利用，又可以最大限度地保護(hù)它們。生物技術(shù)將為中藥這一中華文化瑰寶走向世界起到巨大的推動(dòng)作用。
藥用植物種植培養(yǎng)過(guò)程中存在病毒感染導(dǎo)致品質(zhì)退化和質(zhì)量評(píng)價(jià)體系缺乏科學(xué)性等問(wèn)題。因此，培育脫毒的高品質(zhì)藥用植物植株，建立科學(xué)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，創(chuàng)制品質(zhì)優(yōu)于自然品種的藥用植物新品種等，是目前藥用植物研究開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的熱門(mén)方向。
植物病毒因其干擾宿主體內(nèi)新陳代謝，降低產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至導(dǎo)致死亡而有“植物癌癥”之稱(chēng)。特別是無(wú)性繁殖作物，連年種植易積累多種病毒，從而造成品質(zhì)退化[31]。植物病毒已成為降低農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一。
目前，人類(lèi)發(fā)現(xiàn)的植物病毒已多達(dá)近千種。藥用植物感染的病毒種類(lèi)主要有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus）、芋花葉病毒（Dasheen mosaic virus）、大豆花葉病毒（Soybean mosaic virus）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus）等[32]。全球每年因植物病毒造成的經(jīng)濟(jì)損失約600億美元。因此，加大對(duì)藥用植物脫病毒技術(shù)的研究力度，采取科學(xué)有效的防治措施，是當(dāng)前及今后提升和改良藥用植物品質(zhì)的重點(diǎn)和難點(diǎn)[33]。表 2總結(jié)了近年來(lái)幾種脫毒技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展。
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除表 2中所列的常見(jiàn)脫毒法外，還有花藥或花粉培養(yǎng)、珠心胚培養(yǎng)技術(shù)等，也可一定程度上起到脫病毒效果。
植物新品種指經(jīng)過(guò)人工培育的、對(duì)發(fā)現(xiàn)的野生植物加以引種馴化開(kāi)發(fā)的或者通過(guò)生物技術(shù)改造的植物品種，具有新穎性、特異性、一致性和穩(wěn)定性以及名稱(chēng)確定性的植物品種[45]。
傳統(tǒng)藥用植物新品種創(chuàng)制一般采用雜交育種等方法，如桔梗[46]、丹參[47]等藥材已開(kāi)展雜交育種或雜種優(yōu)勢(shì)利用研究，并創(chuàng)制了新品種。但該方法存在不能產(chǎn)生新基因，且雜交后代會(huì)出現(xiàn)性狀分離，育種過(guò)程緩慢，過(guò)程復(fù)雜等不足?，F(xiàn)代生物技術(shù)方法則開(kāi)辟了新品種創(chuàng)制的新途徑。
誘變育種指利用各種物理、化學(xué)及生物等因素誘導(dǎo)植物發(fā)生基因突變，促進(jìn)基因重組，擴(kuò)大遺傳變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)選擇新品種的育種技術(shù)[48]。
離子束注入誘變技術(shù)是利用注入射程具有可控性、集束性和方向性的荷能離子束，在較輕程度損傷細(xì)胞的情況下，獲得比較高的突變率和比較寬的突變譜，從而選育出新品種的技術(shù)。用不同劑量的12C6+離子束均勻輻照紫蘇種子后，產(chǎn)生了一些染色體畸變，為篩選優(yōu)良變異品種提供了更多可能[49]。說(shuō)明低劑量的12C6+重離子束在輻照誘變新的突變類(lèi)型、培育新的優(yōu)良品種方面具有較大潛力。
太空育種是利用太空特殊環(huán)境使生物基因產(chǎn)生變異，選育新品種、新材料的育種新技術(shù)。其最大優(yōu)勢(shì)在于有可能在較短時(shí)間內(nèi)獲得常規(guī)育種和常規(guī)誘變育種方法難以獲得的罕見(jiàn)基因資源，使植物獲得新基因、新類(lèi)型、新性狀[50]。據(jù)報(bào)道，“天丹一號(hào)”太空丹參由天士力集團(tuán)培育成功。2008年，該集團(tuán)將丹參種子搭載“神七”進(jìn)入太空，返地后經(jīng)株系培養(yǎng)繁育，選育出了“天丹一號(hào)”太空丹參，其有效成分量顯著高于對(duì)照。
誘變育種雖能夠提高突變率，短時(shí)間內(nèi)獲得更多變異類(lèi)型，但誘發(fā)突變的方向難以控制，突變多為有害突變，要獲得更多優(yōu)良性狀，就必須增大突變量。因此，篩選的工作量是相當(dāng)大的。
倍性育種包括單倍體育種和多倍體育種。單倍體育種是單倍體培養(yǎng)技術(shù)與育種實(shí)踐相結(jié)合形成的一種新的育種方法，具有克服遠(yuǎn)緣雜種不育、提高育種效率及選擇效率、迅速獲得純系等優(yōu)點(diǎn)[48]。以發(fā)育時(shí)期的菘藍(lán)花藥為外植體，進(jìn)行培養(yǎng)及單倍體誘導(dǎo)，獲得了單倍體小綠苗。經(jīng)染色體加倍后，一個(gè)世代即可出現(xiàn)純合二倍體，其性狀不分離，表型整齊一致，可顯著縮短育種年限[51]。
多倍體是指染色體數(shù)目在3n或3n以上的個(gè)體、居群和種。多倍體植物有更強(qiáng)的適應(yīng)性和可塑性。藥用植物多倍體具有強(qiáng)抗逆性、高生物產(chǎn)量、低可孕性以及增加某些藥用成分量等特點(diǎn)。最常用的多倍體誘導(dǎo)劑是秋水仙素。秋水仙素誘導(dǎo)法分活體和離體處理加倍法2種[52]?；铙w加倍法包括滴液法、浸泡法、瓊脂法、噴霧法、注射法等。離體加倍法即組織培養(yǎng)誘變法，是用秋水仙素對(duì)植株某一離體部分進(jìn)行處理，再進(jìn)行組培，或在組培過(guò)程中進(jìn)行染色體加倍處理的方法。將秋水仙素和瓊脂混合，制成半固體，然后將其涂抹在植物頂芽或腋芽上誘導(dǎo)多倍體，該方法已在桔梗[53]、金銀花[54]等藥用植物上獲得成功。用適當(dāng)濃度的秋水仙素溶液浸泡懷地黃帶芽莖段，也誘導(dǎo)出了四倍體植株，但是誘導(dǎo)率不高[55]。將石斛的類(lèi)原球莖接種在0.075%秋水仙素的培養(yǎng)基上，獲得了較高的誘導(dǎo)率[56]。通過(guò)離體培養(yǎng)的方法，在誘導(dǎo)紫錐菊染色體加倍上也取得了成功[57]。此外，也可用溫度驟變、機(jī)械創(chuàng)傷、電離射線、非電離射線、離心力等物理因素和有性雜交培育、胚乳培養(yǎng)法、體細(xì)胞雜交法、體細(xì)胞無(wú)性系變異等生物學(xué)方法誘導(dǎo)染色體加倍。
雖然人工誘導(dǎo)多倍體的頻率高、見(jiàn)效快、方法較簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)和育種實(shí)踐中可產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)效益。但同時(shí)也存在毒害、嵌合體現(xiàn)象比較嚴(yán)重、孕性降低、穩(wěn)定耗時(shí)較長(zhǎng)、育種成本高等問(wèn)題[58]。因此，還需在藥用植物多倍體育種上開(kāi)展更多、更廣泛的研究。
轉(zhuǎn)基因育種也稱(chēng)為基因工程育種，可按照人們的意愿將外源基因重組到受體細(xì)胞基因組中使之特異性表達(dá)，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程新品種。其主要優(yōu)勢(shì)是能克服植物遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，擴(kuò)大物種雜交范圍，并加快變異速度等，提供了定向創(chuàng)造生物的可能性[59]。在創(chuàng)制新品種，開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效兼各種抗性作物上可大顯身手。目前，植物轉(zhuǎn)基因主要方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、聚乙二醇介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法、電激穿孔法、顯微注射法及超聲波導(dǎo)入法等。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最多，技術(shù)較為成熟且結(jié)果比較理想的基因轉(zhuǎn)化方法。先往根癌農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入連接有目的基因的植物表達(dá)載體，然后用該農(nóng)桿菌侵染植物，將載體上的目的基因?qū)氩⒄系街参锘蚪M中，從而完成目的基因的轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株?？捎糜谵D(zhuǎn)化較大的DNA片段，能穩(wěn)定遺傳，重復(fù)性好，且不易產(chǎn)生基因沉默，但存在只對(duì)雙子葉植物敏感的缺陷。該方法已成功在丹參[60]、諸葛菜和菘藍(lán)[61]、黃芪[62]、蒿屬植物[63]等材料上取得成功。
基因槍法是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法之后又一個(gè)廣泛應(yīng)用的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。利用火藥爆炸或其他驅(qū)動(dòng)力，將載有外源DNA的金屬顆粒射擊進(jìn)入真空室中的靶細(xì)胞或組織中，從而導(dǎo)入外源基因。該法無(wú)宿主限制、操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化時(shí)間短，但轉(zhuǎn)化率相對(duì)低，外源DNA整合機(jī)制不清楚。近年在大蒜[64]、白三葉[65]等藥用植物上取得了新的成果。
花粉管通道法是在植物授粉后，利用植物開(kāi)花過(guò)程中萌發(fā)的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵，進(jìn)而使目的基因整合到受體植物基因組中，使其自然發(fā)育成種子并形成轉(zhuǎn)基因植株，該方法簡(jiǎn)便、育種時(shí)間短。鐵皮石斛[66]、蓖麻[67]等用該法轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因新品種。表 3對(duì)幾種主要的植物基因轉(zhuǎn)化法特點(diǎn)進(jìn)行了比較。
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轉(zhuǎn)基因在藥用植物上的應(yīng)用雖然已取得相當(dāng)不錯(cuò)的成果，但其安全問(wèn)題一直是爭(zhēng)論的熱點(diǎn)。因此，對(duì)轉(zhuǎn)基因藥用植物還是應(yīng)持有謹(jǐn)慎的態(tài)度，必須進(jìn)行更加系統(tǒng)深入的研究。
次生代謝工程就是用DNA重組技術(shù)修飾生成次生代謝物的生化反應(yīng)途徑或引進(jìn)新的生化反應(yīng)，從而直接提高或抑制某個(gè)或某些特定次生代謝物的合成，改善細(xì)胞性能。隨著藥用植物次生代謝物生物合成途徑的日漸探明，應(yīng)用代謝工程技術(shù)對(duì)植物次生代謝途徑進(jìn)行遺傳改良，以大幅度提高目標(biāo)產(chǎn)物的量已成為研究的熱點(diǎn)。
自1991年美國(guó)學(xué)者Bailey提出次生代謝工程概念以來(lái)，次生代謝工程技術(shù)的應(yīng)用已有大量報(bào)道。早期最為經(jīng)典的研究要屬用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了水稻胚乳中維生素A原（β-胡蘿卜素）的從無(wú)到有[68]。近年來(lái)，該技術(shù)在藥用植物上應(yīng)用的報(bào)道更是層出不窮。藥用植物中各類(lèi)藥效物質(zhì)的量往往很低，無(wú)法滿足人們的需求。通過(guò)次生代謝工程的手段可穩(wěn)定地提高它們?cè)谥参矬w內(nèi)的量。本文簡(jiǎn)要介紹藥用植物中幾類(lèi)重要藥效物質(zhì)通過(guò)次生代謝工程方法提高量的應(yīng)用進(jìn)展。
苯丙素類(lèi)化合物是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)重要的天然有機(jī)化合物，一般具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗自由基、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種生物活性，因此是非常重要的一類(lèi)天然藥效物質(zhì)。
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