Nat,Genet：對(duì)表觀遺傳的遏制或可抑制基因組的不穩(wěn)定性

Nat,Genet：對(duì)表觀遺傳的遏制或可抑制基因組的不穩(wěn)定性

2016年10月13日訊 最近，刊登于國際雜志Nature Genetics上的一項(xiàng)研究報(bào)告中，瑞士巴塞爾弗雷德里希米歇爾研究所的研究人員通過研究發(fā)現(xiàn)，真核生物或許能夠通過特殊的途徑來保護(hù)基因組免于重排以及因重復(fù)DNA而帶來的剔除。人類的基因組就好比是某些簡單動(dòng)物的基因組，比如線蟲，其中充滿著重復(fù)的序列，而其中很多序列都是過去病毒感染的殘留物，這種重復(fù)的DNA通常都處于靜默狀態(tài)。

研究者發(fā)現(xiàn)，這些重復(fù)的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA就能夠產(chǎn)生RNA和DNA的毒性雜交體，而這些異常的R-環(huán)（R-loop）就會(huì)導(dǎo)致缺失和插入，從而影響基因組的完整性；位于組蛋白上的甲基化基團(tuán)就能夠充當(dāng)細(xì)胞機(jī)器中的一種信使來確定是否DNA序列能夠被轉(zhuǎn)錄，而且H3賴氨酸9位上的組蛋白甲基化處于更加緊密地包裹狀態(tài)，而且纏繞在其上面的DNA并不易于到達(dá)轉(zhuǎn)錄機(jī)器，當(dāng)其不能夠被表達(dá)時(shí)，組蛋白甲基化就會(huì)使得基因保持沉默狀態(tài)，然而組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（HMTs）卻能夠參與細(xì)胞的分化以及一系列癌癥的發(fā)生，其特殊的抑制劑目前正處于臨床試驗(yàn)中。

這項(xiàng)研究中，研究者想通過研究闡明，當(dāng)從復(fù)雜有機(jī)體中消除大量組蛋白修飾后會(huì)發(fā)生什么，研究者發(fā)現(xiàn)HMTs在發(fā)育過程中是非常必要的，而且其在基因組穩(wěn)定性上扮演著重要角色。HMTs能夠?qū)M蛋白H3在賴氨酸9位上進(jìn)行甲基化（H3K9me HMTs），哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中至少含有8種H3K9的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，研究者發(fā)現(xiàn)，重復(fù)性元件中H3K9me的存在非常重要，當(dāng)H3K9甲基化缺失時(shí)，這些區(qū)域就會(huì)轉(zhuǎn)錄成為RNA，而且不合適的轉(zhuǎn)錄往往和插入、缺失以及拷貝數(shù)變化直接相關(guān)，缺少特殊的HMTs會(huì)直接導(dǎo)致基因組突變率水平的提高。

當(dāng)細(xì)胞中的復(fù)制機(jī)器被阻斷時(shí)，不必要的DNA損傷就會(huì)產(chǎn)生，而其中一個(gè)常見的原因就是具有轉(zhuǎn)錄作用的DNA復(fù)制聚合酶的“碰撞”導(dǎo)致的，研究者假設(shè)，R環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生在H3K9me缺失的線蟲機(jī)體中發(fā)現(xiàn)的突變。最后研究者Gasser說道，對(duì)于目的是抑制H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶的癌癥療法而言，本文研究或許是一條重大新聞；我們并不想利用一種癌癥療法的制劑來使得健康細(xì)胞的基因組變得不穩(wěn)定，尤其是考慮到H3K9me的缺失會(huì)以驚人的速度引入缺失和插入；后期研究中研究者希望能夠闡明是否本文中對(duì)線蟲的研究結(jié)果能夠直接影響人類癌癥的靶向性療法。

綜述-測序時(shí)代的結(jié)構(gòu)變異

該文大部分來自Nature Reviews Genetics的綜述“Structural variation in the sequencing era” 的翻譯，詳細(xì)內(nèi)容請(qǐng)閱讀 原文 。

鑒定結(jié)構(gòu)變異對(duì)于進(jìn)一步了解基因組的特征至關(guān)重要。但由于之前的基因組測序技術(shù)具有明顯的局限性，鑒定結(jié)構(gòu)變異一直是一個(gè)難題。隨著第三代單分子測序和相關(guān)鑒定算法的發(fā)展，以使數(shù)百萬SV的鑒定成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，SV與疾病和一些生物機(jī)制的調(diào)控密切相關(guān)。鑒于SV的類型和大小的多變性，以及新的基因組技術(shù)的檢測偏差，因此，解決多平臺(tái)間造成的差異，構(gòu)造較為一致的結(jié)構(gòu)變異圖譜很有必要。作者回顧了當(dāng)前鑒定SV的方法，并提出將生物學(xué)信息與SV結(jié)合起來將對(duì)全面了解SV對(duì)人類基因組的影響是很必要的。

個(gè)體間遺傳變異一般分為兩種，一類是長度<50bp的，包括單核苷酸變異（ single- nucleotide variants, SNVs）和小的插入和刪除（indels）；另一類是> 50 bp的結(jié)構(gòu)變異（ structural variations，SVs）。進(jìn)一步可以將SV細(xì)分為非平衡的拷貝數(shù)變異（CNVs），包括插入，刪除和重復(fù)；以及平衡的重排，包括倒位和染色體內(nèi)及染色體間的易位。此外，SV還包括轉(zhuǎn)座子插入，拷貝數(shù)高度可變的多等位基因CNV，片段重復(fù)和復(fù)雜重排。

相較于SNV等鑒定的準(zhǔn)確性和研究的廣泛性，SV的鑒定和分析卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后，這是由于SV的鑒定不準(zhǔn)確并且對(duì)應(yīng)的參考基因組也缺乏多樣性，樣本量和測序深度。隨著新的測序技術(shù)和SV鑒定算法的發(fā)展，使得集合多個(gè)軟件來從多種測序技術(shù)的數(shù)據(jù)中鑒定SV成為可能。

SV的檢測策略一般包括4種：Read-pair，Read-depth，Split-read，Sequence assembly，關(guān)于其詳細(xì)的介紹可參考這篇文章： 一篇文章說清楚基因組結(jié)構(gòu)性變異檢測的方法 。然而，現(xiàn)有的大多數(shù)軟件采用的為單一的檢測策略，因此不能很好的全面檢測結(jié)構(gòu)變異。所以，比較好的方式就是進(jìn)行多策略多工具整合，以全面檢測結(jié)構(gòu)變異。但這樣又會(huì)帶來一個(gè)問題，多個(gè)軟件的結(jié)果如何合并和過濾，作者根據(jù)已有的研究，總結(jié)了主要的幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，包括斷點(diǎn)置信區(qū)間重疊情況，斷點(diǎn)距離，鑒定錯(cuò)誤率的大小，采取的鑒定策略優(yōu)先級(jí)，鑒定結(jié)果的一致性等，幾乎所有的整合工具都考慮了SV的坐標(biāo)是否重疊，總結(jié)一下也就是下面這張圖：

現(xiàn)有的整合多種策略進(jìn)行SV鑒定的工具（針對(duì)二代測序數(shù)據(jù)）有如下幾個(gè)：

這些整合多策略的工具仍然有其局限性，主要是由二代短讀長數(shù)據(jù)導(dǎo)致，大片段的結(jié)構(gòu)變異無法準(zhǔn)確檢測到，僅能檢測重復(fù)區(qū)域之外的小片段的SV。

合成長reads測序技術(shù)有很多，包括合并克隆測序，Illumina合成長reads測序，10x Genomics reads連接測序等。這種長reads很適合用來鑒定SV，由于低錯(cuò)誤率和讀長較長（多達(dá)100kb），因此很多時(shí)候用來構(gòu)建單體型。利用這種數(shù)據(jù)鑒定SV的方法有Long Ranger，GROC- SVs，LinkedSV，NAIBR，VALOR2，ZoomX，詳細(xì)見下表：
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該方法僅對(duì)雙鏈中的模板鏈進(jìn)行測序，因只含一條鏈，故該方法可以用來構(gòu)建單倍型。該測序方法可以用于檢測倒位，大片段的缺失和重復(fù)等，相應(yīng)地檢測工具有BAIT和Invert.R。
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Hi-C的reads長度可以達(dá)到Mbp級(jí)別，從而使得其適合用于檢測大片段的SV，尤其是易位，檢測出的SV片段大小一般大于2Mb。然而由于reads長度太長，Hi-C并不適合檢測小片段的SV。檢測的工具主要包括HiCNV + HiCtrans，Hi-C Breakfinder。
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檢測SV的算法一般通過利用reads內(nèi)部和reads之間的特征來檢測SMRT數(shù)據(jù)中的SV。對(duì)于reads內(nèi)部的特征，可以直接用來鑒定SV，一般是序列刪除和插入。而對(duì)于reads之間的特征，可能涉及多個(gè)reads，相關(guān)檢測工具一般是通過在reads與參考基因組比對(duì)后的結(jié)果中從reads方向，位置等的異常中檢測出SV。采用這種方法的工具有CORGi，PBHoney，pbsv，Sniffles，SMRT-SV，SVIM。
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用于從ONT數(shù)據(jù)中檢測SV的方法與PacBio數(shù)據(jù)中的類似，工具主要包括 NanoSV, Picky, Sniffles，SVIM。有研究表明，ONT數(shù)據(jù)的檢測SV工具對(duì)于小片段的SV的檢測并不準(zhǔn)確，所以，ONT數(shù)據(jù)并不適用于檢測小片段SV（< 200bp）。

光學(xué)圖譜系統(tǒng)基于單分子光學(xué)圖譜技術(shù)，通過其特有的芯片技術(shù)使完整的單一DNA分子可以在納米通道中平行排列，拍照成像，可以展示更完整的基因圖譜。通過將光學(xué)圖譜上的標(biāo)記于已酶切的參考基因組比較來鑒定SV：缺失或多余的標(biāo)記以及標(biāo)記間的距離可以用來確定是否有缺失或插入；重復(fù)的標(biāo)簽表明有序列重復(fù)；非參考序列上存在獨(dú)特的切口表示有易位；切口反向表示有倒位。光學(xué)圖譜生成的片段一般長達(dá)1Mb，從而使得其適合于檢測大片段的重排和插入，也可檢測重復(fù)區(qū)域中的。由于光學(xué)圖譜產(chǎn)生的片段是酶切過的，所以檢測SV的分辨率很難達(dá)到堿基級(jí)別。由于光學(xué)圖譜的成本較低，所以在只是檢測一些大片段的SV時(shí)選光學(xué)圖譜還是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。相應(yīng)的檢測工具主要包括 OMSV，Bionano Solve。

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利用多個(gè)平臺(tái)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)來檢測SV，這方面的工具主要有兩個(gè)：MultiBreak- SV，HySA。
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有一些工具也可以用來檢測一些復(fù)雜的SV，列舉如下：
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對(duì)于不同平臺(tái)的數(shù)據(jù)，SV在其中的表現(xiàn)形式也不太相同，作者為此進(jìn)行了總結(jié)：

SV不只是檢測完就這么簡單，還需要闡明發(fā)生SV背后的生物學(xué)機(jī)制以及造成的影響，這就需要將鑒定到的SV與現(xiàn)有的生物學(xué)信息（包括基因表達(dá)，表觀遺傳和三維基因組結(jié)構(gòu)）結(jié)合起來綜合分析，才能達(dá)到最終的研究目的。有研究就發(fā)現(xiàn)，SV比SNV和indels對(duì)基因表達(dá)的影響要大很多。作者也進(jìn)行了相關(guān)總結(jié)，以幫助理如何將SV與其他生物學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合分析。
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Ho, S.S., Urban, A.E. & Mills, R.E. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet (2019) doi:10.1038/s41576-019-0180-9

淺談全基因組復(fù)制

多倍化（polyploidy）或全基因加倍/復(fù)制（whole genome duplication, WGD）事件是指基因組內(nèi)的所有序列都發(fā)生重復(fù)，重復(fù)為生物進(jìn)化提供了原始的遺傳材料，使植物基因組快速重組，丟失大量基因，增加結(jié)構(gòu)變異，對(duì)植物進(jìn)化極其重要。

多倍體植物廣泛存在于自然界中，如日常生活中的馬鈴薯、小麥、棉花等。多倍化事件或全基因組復(fù)制事件直接將染色體進(jìn)行加倍，被認(rèn)為是一種物種分化的驅(qū)動(dòng)力。研究發(fā)現(xiàn)多倍化在有花植物進(jìn)化過程中十分頻繁，在現(xiàn)存的被子植物和種子植物分化之前，都分別發(fā)生過加倍事件，可能對(duì)花和種子的產(chǎn)生有重要貢獻(xiàn) （Jiao et al., 2011）?；蚪M加倍為物種提供了豐盛的演化材料（圖1）。被認(rèn)為是提升了物種多樣性、環(huán)境適應(yīng)能力等（Jiao, 2018）。多倍化后的物種需要在原植物多倍化的研究對(duì)于生物進(jìn)化、物種保護(hù)及遺傳育種等方面都具有重要的理論指導(dǎo)意義及實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。

鑒定全基因組復(fù)制的方法一般可以通過以下三種：

下面我們就前兩種方式進(jìn)行重點(diǎn)介紹。

基因組共線性是基因組加倍比較直接的證據(jù)，通過比較兩個(gè)基因組的序列并將共線性的區(qū)域作圖展示，可以直觀發(fā)現(xiàn)全基因組加倍的痕跡，如圖2（左）蘋果基因組（Daccord et al., 2017）的circos圖中，可以明顯染色體間大片段的共線性，表明該物種近期發(fā)生了全基因組復(fù)制。在向日葵基因組（Badouin et al., 2017）中，通過基因組自身的比對(duì)展示如圖2（右），對(duì)角線為物種自身的基因和其本身的共線性。其余的點(diǎn)為基因組其他位置的旁系同源基因?qū)?。圖中紅色圓圈標(biāo)注的位置，表明這兩段之間具有一定的共性，為基因組加倍事件留下的痕跡。

如果物種經(jīng)歷過多次全基因組加倍事件，近期的加倍事件會(huì)加速早期加倍事件的基因丟失，早期的加倍事件痕跡往往越來越不明顯，共線性直觀上不明顯，這就需要我們探索其他方式來挖掘加倍事件，這就用到了4DTv和Ks的信息。下面我們對(duì)這兩種方式來進(jìn)行簡單的介紹。

同義突變指突變并不影響氨基酸序列，進(jìn)而不會(huì)影響蛋白結(jié)構(gòu)與功能。一般認(rèn)為，同義突變不受自然選擇，同義突變率（Ks）的計(jì)算為同義突變SNP數(shù)/同義位點(diǎn)數(shù)。由于同義位點(diǎn)突變不會(huì)引起氨基酸的變化，可以認(rèn)為對(duì)編碼蛋白沒有影響，那么密碼子同義位點(diǎn)的變化是完全隨機(jī)的，并隨時(shí)間推移累積。如果物種發(fā)生了全基因組加倍事件，現(xiàn)有基因組中會(huì)有一定數(shù)量的基因保留下來，這些基因在進(jìn)化過程中累積的同義突變接近，計(jì)算得到的Ks值也接近，在某一個(gè)Ks值處會(huì)形成一個(gè)峰（ks peak）。如果這處Ks值的基因數(shù)目足夠多，就會(huì)形成比較間的峰值，可以認(rèn)為在進(jìn)化過程中該處發(fā)生過全基因組加倍事件。全基因組加倍發(fā)生的時(shí)間越久遠(yuǎn)，基因丟失越多，發(fā)生的變化也要越大，形成的Ks峰越扁平，影響對(duì)全基因組加倍事件的判斷。

4DTv與Ks有異曲同工之處（Tang et al., 2008），如果密碼子的某個(gè)位點(diǎn)上任何核苷酸的改變都不影響其都編碼的氨基酸，則稱這個(gè)位點(diǎn)為4倍簡并位點(diǎn)（fourfold degenerate site）是指共線性區(qū)段所包含的基因?qū)Φ?DTV值可反映物種在進(jìn)化史中的物種相對(duì)分化事件以及全基因組復(fù)制事件。4DTV指4D位點(diǎn)上發(fā)生顛換（嘌呤突變?yōu)猷奏せ蛘哙奏ね蛔優(yōu)猷堰剩┑奈稽c(diǎn)所占的比例。

以辣椒基因組文章中的4DTv和罌粟基因組文章中的Ks結(jié)果為例，解析全基因組復(fù)制事件。在辣椒基因組（Qin et al., 2014）文章中（如圖3），選取了辣椒（pepper）、葡萄（grape）、土豆（potato）、番茄（tomato）進(jìn)行4DTv分析。結(jié)果如下圖。從圖中可以看出在辣椒和葡萄分后（黃色線，4DTv值0.5處），茄科植物辣椒、土豆和番茄在分化之前共同發(fā)生了全基因組復(fù)制（圖中指示W(wǎng)GD位置，黑線、藍(lán)線和紅線在4DTv值0.3處的峰值），之后辣椒和番茄分開（圖中綠線，4DTv值0.1處）。關(guān)于4DTv如何推斷全基因組加倍時(shí)間，文章中也給出了建議：在4DTv值0.48和0.1處分別為辣椒和葡萄、辣椒和番茄的物種分化時(shí)間，對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)為?89和20Mya，辣椒、番茄和土豆共有的全基因組加倍事件在4DTv值約0.3處，基于此可以大致推斷該全基因組復(fù)制事件發(fā)生的時(shí)間約在55Mya。

在罌粟基因組文章(Guo et al., 2018)中，選取了罌粟（opium poppy）、耬斗菜（Aquilegia coerulea）、蓮（otus）、葡萄（grape）、擬南芥（Arabidopsis）進(jìn)行Ks分析，結(jié)果如圖4，從Ks峰圖和進(jìn)化樹可以看出，葡萄和罌粟在Ks值約1.6處（黃線）分開，葡萄在Ks值約1.4處（綠線）發(fā)生了核心雙子葉植物共有的全基因組三倍化事件，耬斗菜在Ks值約1.0-1.2處發(fā)生了單獨(dú)的全基因組復(fù)制，由于復(fù)制時(shí)間比較久遠(yuǎn)，所以峰較為扁平，蓮在Ks值約0.5處發(fā)生了單獨(dú)的全基因組復(fù)制事件，罌粟在Ks值約0.1處發(fā)生了全基因組復(fù)制，這是一個(gè)較為近期的全基因組復(fù)制事件。通過公式T=Ks/2r可以計(jì)算全基因組加倍事件發(fā)生的時(shí)間，r為核苷酸替代率，在文章中使用了6.98 × 10-9，計(jì)算得到的加倍時(shí)間在7.8百萬年前。

全基因組加倍后的復(fù)制基因的命運(yùn)各有不同，其保留與丟失是否有偏向性？哪些基因傾向于保留，保留基因功能是否發(fā)生變化？保留的重復(fù)基因及其對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化的影響？基因組加倍在被子植物的適應(yīng)性進(jìn)化中發(fā)揮的作用，如何幫助植物適應(yīng)劇烈環(huán)境變化等（Wu et al., 2020），這些都是全基因組復(fù)制后續(xù)可以挖掘的內(nèi)容，在此不做過多介紹。

Badouin, H., Gouzy, J., Grassa, C.J., Murat, F., Staton, S.E., Cottret, L., Lelandais-Briere, C., Owens, G.L., Carrere, S., Mayjonade, B., et al. (2017). The sunflower genome provides insights into oil metabolism, flowering and Asterid evolution. Nature 546, 148-152.

Daccord, N., Celton, J.M., Linsmith, G., Becker, C., Choisne, N., Schijlen, E., van de Geest, H., Bianco, L., Micheletti, D., Velasco, R., et al. (2017). High-quality de novo assembly of the apple genome and methylome dynamics of early fruit development. Nat Genet 49, 1099-1106.

Guo, L., Winzer, T., Yang, X., Li, Y., Ning, Z., He, Z., Teodor, R., Lu, Y., Bowser, T.A., Graham, I.A., et al. (2018). The opium poppy genome and morphinan production. Science 362, 343-347.Jiao, Y. (2018). Double the Genome, Double the Fun: Genome Duplications in Angiosperms. Mol Plant 11, 357-358.

Jiao, Y., Wickett, N.J., Ayyampalayam, S., Chanderbali, A.S., Landherr, L., Ralph, P.E., Tomsho, L.P., Hu, Y., Liang, H., Soltis, P.S., et al. (2011). Ancestral polyploidy in seed plants and angiosperms. Nature 473, 97-100.

Qin, C., Yu, C., Shen, Y., Fang, X., Chen, L., Min, J., Cheng, J., Zhao, S., Xu, M., Luo, Y., et al. (2014). Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization. Proc Natl Acad Sci U S A 111, 5135-5140.

Tang, H., Wang, X., Bowers, J.E., Ming, R., Alam, M., and Paterson, A.H. (2008). Unraveling ancient hexaploidy through multiply-aligned angiosperm gene maps. Genome Res 18, 1944-1954.

Wu, S., Han, B., and Jiao, Y. (2020). Genetic Contribution of Paleopolyploidy to Adaptive Evolution in Angiosperms. Mol Plant 13, 59-71.

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