南開大學(xué):“自殺式”CRISPR/Cas9系統(tǒng)

2016年08月28日訊 來自南開大學(xué)和北京師范大學(xué)的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表題為“A ‘suicide’ CRISPR-Cas9 system to promote gene deletion and restoration by electroporation in Cryptococcus neoformans”的研究論文。這項研究提出了一種“自殺式” CRISPR-Cas9系統(tǒng)，使我們能夠通過后續(xù)的互補作用，驗證基因的功能，并有可能減少脫靶效應(yīng)。因此，這項技術(shù)適用于新型隱球菌的功能基因組學(xué)研究。

作為原核生物的一種適應(yīng)性免疫機制，集群定期間隔短回文重復(fù)（CRISPR）和CRISPR相關(guān)（CRISPER-Cas）系統(tǒng)，使宿主能夠防御噬菌體和其他可移動的元素和載體。CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因組編輯中的效力廣受好評，特別是難以進(jìn)行遺傳操縱的生物體。為了構(gòu)建這一系統(tǒng)，需要兩個基本組成部分：一個單一的嵌合引導(dǎo)性RNA（gRNA）成分，是通過將約20nt的靶序列RNA（crRNA）與一段訂制的細(xì)菌tracrRNA、以及細(xì)菌Cas9內(nèi)切酶的一個蛋白質(zhì)成分融合而產(chǎn)生的。

這一系統(tǒng)通常被轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞以進(jìn)行功能表達(dá)。用以gRNA和Cas9核酸酶生產(chǎn)的表達(dá)組件將在很大程度上持續(xù)存在于宿主中--甚至在編輯過程完成后，作為異位整合副本或自由復(fù)制的DNA分子（minichromosomes）。因此，這種方法有其固有的缺陷，如Cas9內(nèi)切酶的潛在毒性和伴隨細(xì)胞增殖而積累的靶基因突變。觸發(fā)不良遺傳學(xué)變化的CRISPR-Cas9系統(tǒng)通常出現(xiàn)脫靶效用，在某些生物中CRISPR-Cas9是有細(xì)胞毒性的，包括釀酒酵母和裂殖酵母。

科學(xué)家在研究中遇到的另一個實際問題是，CRISPR-Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞中的持久性，會阻止新生隱球菌（C. neoformans）中突變基因的修復(fù)，因為該系統(tǒng)也靶定包含相同gRNA靶序列的互補基因。這種局限性代表了一個重要的問題，在編輯系統(tǒng)的實際應(yīng)用中必須解決，因為CRISPR-Cas9表達(dá)組件的體內(nèi)存在，并不適于許多的應(yīng)用（例如，生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)）。即使是在微生物的實驗室研究中，剩余的CRISPR-Cas9 DNA也會降低該系統(tǒng)作為基因組操縱工具的有利度。

擔(dān)子菌酵母新型隱球菌（C. neoformans）作為艾滋病相關(guān)真菌病和其他基本生物問題的一種模型，已經(jīng)得以廣泛的研究，并存在低的同源重組頻率，特別是D型菌株。目前已經(jīng)開發(fā)出來兩種不同的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)--基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔轉(zhuǎn)化，通過同源重組破壞許多基因。然而，這些方法實現(xiàn)的同源重組頻率，在A型和D型菌株之間有著顯著的差異?；驑屴D(zhuǎn)化是一種昂貴的程序，可以通過同源重組實現(xiàn)A型菌株的基因破壞，頻率在2%和50%之間，而D型菌株系列的頻率在1%和4%之間。

此外，在D型菌株中，電穿孔轉(zhuǎn)化可引起1/1000到1/100,000的同源重組頻率。其他基因組編輯技術(shù)，例如鋅指核酸酶或TAL效應(yīng)物核酸酶（TALENS），在這種菌一直沒有相關(guān)報道。因此，構(gòu)建一個功能性CRISPR-Cas9系統(tǒng)來進(jìn)行靶向基因刪除和基因重組，用于酵母的毒性研究，有著重要的意義。

在這項研究中，研究人員報道了一種自發(fā)消除CRISPR-Cas9系統(tǒng)的方法，而不會影響其強大的編輯功能。該研究小組在一種內(nèi)源性U6啟動子和人密碼子優(yōu)化的Cas9內(nèi)切酶的驅(qū)動下，成功地表達(dá)了單個引導(dǎo)RNA。該系統(tǒng)可在酵母中有效地生成一個插入缺失突變，并通過電穿孔法，經(jīng)由同源同源性修復(fù)，有效地進(jìn)行靶向基因中斷。

然后，該研究小組通過CRISPR-Cas9表達(dá)組件到重組構(gòu)建的順式排列，證明了該系統(tǒng)的自發(fā)消除。在系統(tǒng)介導(dǎo)的雙交換之后，CRISPR-Cas9組件被裂解和降解，這可通過Southern blotting得以驗證。這種“自殺式” CRISPR-Cas9系統(tǒng)，使我們能夠通過后續(xù)的互補作用，來驗證基因的功能，并有可能減少脫靶效應(yīng)。因此，這項技術(shù)有潛力用于新型隱球菌的功能基因組學(xué)研究。

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