浙江大學(xué)最新文章利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除基因

2016年08月28日訊 基因組編輯技術(shù)（Genome editing）是通過基因工程表達(dá)的序列特異的核酸酶對基因組進(jìn)行切割，實現(xiàn)基因定點敲除、敲入等修飾，在基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的反向遺傳學(xué)研究、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的種質(zhì)改良和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基因治療等方面有重要的應(yīng)用價值。

來自浙江大學(xué)生科院的研究人員在 Golden-gate 克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過兩輪 PCR 反應(yīng)，建立了將每 3 個sgRNA 串聯(lián)到同一個入門載體中的方法體系，Golden-gate 克隆技術(shù)的核心是用 IIs 型限制性核酸內(nèi)切酶，該類酶的切割序列位于識別序列之外，從而能產(chǎn)生多種粘性末端，有利于多個 DNA 片段按照指定的意向連接。這項研究獲得了擬南芥（Arabidopsis thaliana）IAA2 基因的堿基插入突變和大片段缺失突變，整個實驗體系具有快速、高效等優(yōu)點。

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古生菌抵抗病毒或外源質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，主要有 3 種類型： I型、 Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組編輯技術(shù)。嗜熱性鏈球菌（Streptococcus thermophilus）具有典型的Ⅱ型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)，該系統(tǒng)編碼tracrRNA（Trans-activating crRNA），能指導(dǎo) RNaseⅢ和 Cas9 完成前體 crRNA 的成熟；隨后， tracrRNA與成熟的 crRNA 的互補序列配對形成 RNA 二聚體，作為向?qū)?RNA（Guide RNA, gRNA），引導(dǎo) Cas9 蛋白識別和降解入侵的外源 DNA。通過人工設(shè)計，研究者將 tracrRNA/crRNA 二聚體改造成單一向?qū)NA（Single guide RNA, sgRNA），極大方便了基因組編輯技術(shù)的研究。

Cas9 蛋白是一種核酸內(nèi)切酶，含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域： RuvC-like 結(jié)構(gòu)域和 HNH 核酸酶結(jié)構(gòu)域。HNH 結(jié)構(gòu)域切割與 crRNA 互補的模板 DNA 鏈，切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif, PAM）上游 3nt 處；而 RuvC-like 結(jié)構(gòu)域?qū)α硪粭l DNA 鏈進(jìn)行切割，切割位點位于 PAM 上游 3--8nt 處。

在基因組編技術(shù)中， sgRNA 指導(dǎo) Cas9蛋白在目的基因的 PAM（保守堿基序列為 NGG）上游切割，產(chǎn)生 DNA 雙鏈斷裂（Double strands break,DSB）。 DSB 產(chǎn)生以后，細(xì)胞主要通過兩種方式進(jìn)行修復(fù)：同源重組（Homologous recombination, HR）和非同源末端連接（Nonhomologous end joining,NHEJ）。

多細(xì)胞真核生物主要通過 NHEJ 的方式修復(fù) DSB。由于 NHEJ 只是將斷裂的 DNA 片段進(jìn)行簡單的加工之后連接起來，常常會在斷裂位點產(chǎn)生堿基的缺失或插入，造成基因突變。1 個 sgRNA 只能靶向基因的 1 個位點，有時基因突變的效率并不高，這是因為預(yù)測 sgRNA 效率的體系和方法還不是很完善。多個 sgRNA 能靶向同一基因的不同位點，提高基因突變的頻率；也能造成較大片段的缺失突變，適用于 miRNA 基因的基因組編輯和某些疾病模型的建立。另外，多個 sgRNA 也能靶向不同的基因，特別是同一信號通路、同一代謝途徑或同一基因家族的基因，在基礎(chǔ)生命科學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值。

IAA2（Indole Acetic Acid 2）是擬南芥Aux/IAA生長素響應(yīng)基因大家族中的一員，目前還沒有它的突變體的報道，阻礙了對其功能和作用機制的深入研究。在CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)中，1個sgRNA只能靶向基因的1個位點，有時基因敲除的效率并不高。

為了提高敲除效率，在這篇文章中，研究人員在Golden-Gate克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過兩輪PCR擴增，將每3個sgRNA串聯(lián)到同1個入門載體中，再將入門載體與含Cas9表達(dá)框的目標(biāo)載體LR反應(yīng)，獲得最終的表達(dá)載體。

結(jié)果表明，設(shè)計的6個sgRNA有4個發(fā)揮了作用，產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變。與單個sgRNA相比，多重sgRNA的基因敲除效率高、種系突變多；與其他構(gòu)建多重sgRNA載體的方法相比，本方法具有快速、高效等優(yōu)點。研究所得到的5個突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料。

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